Rola mitochondriów w kształtowaniu rozwoju zarodków ssaków, od zapłodnienia do pierwszych sygnałów indukujących różnicowanie komórek
Type
Project
Date Issued
2023
Author
Zofia Eliza Madeja
Discipline
biotechnology
animal science and fisheries
Abstract (PL)
Mitochondria są niezwykłymi organellami komórkowymi, które prawdopodobnie umiejscowiły się w komórkach eukariotycznych na zasadzie endosymbiotycznej resorpcji bakterii (2.5 biliona lat temu) występują u wszystkich eukariontów, mają średnicę 0,2-1μm. Mitochondria posiadają własny genom (tzw. mitochondrialne DNA) i pełnią funkcję centrum energetycznego komórki. To dzięki ich funkcji zachodzą procesy oddychania wewnątrzkomórkowego. Mitochondria występuje u wszystkich eukariontów i odgrywają ważną rolę w wielu procesach komórkowych, włączając w to (poza magazynowaniem energii w postaci trójfosforanu adenozyny, ATP), regulację poziomu wapnia w komórce, wymianę sygnałów wewnątrz i między komórkową, programowaną śmierć komórki (apoptozę) oraz starzenie się komórek. Ponadto, mitochondria kontrolują różnicowanie się komórek i cykl komórkowy, a także warunkują prawidłowe podziały komórkowe. Wszystkie nieprawidłowości w funkcjonowaniu mitochondriów mogą stanowić podłoże chorób.
Procesy związane z powstawaniem gamet i zarodków wymagają wysokich nakładów energetycznych, ale również pod wieloma względami są unikalne pod względem przemian które zachodzą w tych komórkach. Procesy te obejmują bardzo intensywną syntezę materiałów zapasowych (w tym transkryptów i białek), co wymaga koordynacji przemian metabolicznych z procesami które mają miejsce na poziomie jądra komórkowego (DNA) jak i z procesami podziału komórki (prawidłowa segregacja chromosomów do komórek potomnych). Osiągnięcie pełnego potencjału rozwojowego przez gamety i zarodki (czyli zdolność do wytworzenia prawidłowego dorosłego organizmu) jest nierozerwalna z ich jakością. Proces oogenezy (powstawania żeńskich komórek rozrodczych) jest wysoce zależny od prawidłowego funkcjonowanie mitochondriów. Co ciekawe, na wczesnym etapie rozwoju zarodka nie obserwuje się biogenezy mitochondriów, kolejne pokolenia komórek dziedziczą mitochondria od „matki” – czyli zapłodnionej komórki jajowej. Ponowna synteza mitochondriów rozpoczyna się dopiero w stadium blastocysty – czyli tuż przed implantacja zarodka. Z badań naukowych wiemy, że podczas wczesnego rozwoju zarodka ssaka, poza funkcją energetyczną mitochondria mogą wpływać na regulację szeregu procesów rozwojowych, tak różnorodnych jak regulacja ekspresji genów, modyfikacje na poziomie genomu, regulacja aktywności ścieżek sygnalizacyjnych oraz prawdopodobnie prawidłowe rozchodzenie się chromosomów do komórek potomnych podczas podziału. Jest to niezwykle fascynujące odkrycie, ponieważ gro niepowodzeń w rozrodzie na poziomie wczesnej implantacji zarodka wynika właśnie z niestabilności genomu. Podobne obserwacje prowadzi się dla zwierząt i ludzi. W związku z powyższym, projekt ten zakłada wielowymiarowe zbadanie rozmieszczenia i funkcji mitochondriów we wczesnych (przedimplantacyjnych zarodkach). Nasz model badawczy stanowią zarodki bydlęce uzyskane w warunkach in vitro, ponieważ w świetle dzisiejszej wiedzy stanowią one doskonały model do badania wczesnego rozwoju ssaków, w tym człowieka. Nasze badania będą obejmowały między innymi prace mające na celu opisanie związku aktywności i rozmieszczenia mitochondriów z jakością zarodków. Badania prowadzone będą na poziomie mitochondrialnego DNA i RNA powstałego na bazie genomowego DNA (analiza wszystkich transkryptów znajdujących się w pojedynczej komórce zarodka). Badany będzie również związek mitochondriów z rozchodzeniem się chromosomów do komórek potomnych. W tych badaniach zastosowane zostaną nowoczesne metody diagnostyki poziomu aneuploidii w zarodku (zaburzeń dotyczących liczby chromosomów) oraz klasyczne metody cytogenetyczne. Planowane jest również poznanie wpływu reaktywnych form tlenu (które powstaje w wyniku metabolizmu ATP) na regulację ścieżek sygnalizacyjnych kluczowych dla różnicowanie komórek zarodkowych. Planujemy zastosowanie najnowszych technik biologii molekularnej i mikroskopii konfokalnej, w tym techniki mikroskopii wysokorozdzielczej STED (Mikroskopii Wymuszonego Wygaszania Emisji).
Wyniki badań prowadzonych w ramach niniejszego projektu pomogą lepiej zrozumieć mechanizmy odpowiedzialne za jakość zarodków, w tym tych uzyskiwanych w warunkach in vitro, co może stanowić również cenną wiedze dla embriologów pracujących nie tylko we wspomaganym rozrodzie człowieka, ale również w rozrodzie zwierząt hodowlanych (głównie bydła), co samo w sobie posiada duży potencjał aplikacyjny.
Procesy związane z powstawaniem gamet i zarodków wymagają wysokich nakładów energetycznych, ale również pod wieloma względami są unikalne pod względem przemian które zachodzą w tych komórkach. Procesy te obejmują bardzo intensywną syntezę materiałów zapasowych (w tym transkryptów i białek), co wymaga koordynacji przemian metabolicznych z procesami które mają miejsce na poziomie jądra komórkowego (DNA) jak i z procesami podziału komórki (prawidłowa segregacja chromosomów do komórek potomnych). Osiągnięcie pełnego potencjału rozwojowego przez gamety i zarodki (czyli zdolność do wytworzenia prawidłowego dorosłego organizmu) jest nierozerwalna z ich jakością. Proces oogenezy (powstawania żeńskich komórek rozrodczych) jest wysoce zależny od prawidłowego funkcjonowanie mitochondriów. Co ciekawe, na wczesnym etapie rozwoju zarodka nie obserwuje się biogenezy mitochondriów, kolejne pokolenia komórek dziedziczą mitochondria od „matki” – czyli zapłodnionej komórki jajowej. Ponowna synteza mitochondriów rozpoczyna się dopiero w stadium blastocysty – czyli tuż przed implantacja zarodka. Z badań naukowych wiemy, że podczas wczesnego rozwoju zarodka ssaka, poza funkcją energetyczną mitochondria mogą wpływać na regulację szeregu procesów rozwojowych, tak różnorodnych jak regulacja ekspresji genów, modyfikacje na poziomie genomu, regulacja aktywności ścieżek sygnalizacyjnych oraz prawdopodobnie prawidłowe rozchodzenie się chromosomów do komórek potomnych podczas podziału. Jest to niezwykle fascynujące odkrycie, ponieważ gro niepowodzeń w rozrodzie na poziomie wczesnej implantacji zarodka wynika właśnie z niestabilności genomu. Podobne obserwacje prowadzi się dla zwierząt i ludzi. W związku z powyższym, projekt ten zakłada wielowymiarowe zbadanie rozmieszczenia i funkcji mitochondriów we wczesnych (przedimplantacyjnych zarodkach). Nasz model badawczy stanowią zarodki bydlęce uzyskane w warunkach in vitro, ponieważ w świetle dzisiejszej wiedzy stanowią one doskonały model do badania wczesnego rozwoju ssaków, w tym człowieka. Nasze badania będą obejmowały między innymi prace mające na celu opisanie związku aktywności i rozmieszczenia mitochondriów z jakością zarodków. Badania prowadzone będą na poziomie mitochondrialnego DNA i RNA powstałego na bazie genomowego DNA (analiza wszystkich transkryptów znajdujących się w pojedynczej komórce zarodka). Badany będzie również związek mitochondriów z rozchodzeniem się chromosomów do komórek potomnych. W tych badaniach zastosowane zostaną nowoczesne metody diagnostyki poziomu aneuploidii w zarodku (zaburzeń dotyczących liczby chromosomów) oraz klasyczne metody cytogenetyczne. Planowane jest również poznanie wpływu reaktywnych form tlenu (które powstaje w wyniku metabolizmu ATP) na regulację ścieżek sygnalizacyjnych kluczowych dla różnicowanie komórek zarodkowych. Planujemy zastosowanie najnowszych technik biologii molekularnej i mikroskopii konfokalnej, w tym techniki mikroskopii wysokorozdzielczej STED (Mikroskopii Wymuszonego Wygaszania Emisji).
Wyniki badań prowadzonych w ramach niniejszego projektu pomogą lepiej zrozumieć mechanizmy odpowiedzialne za jakość zarodków, w tym tych uzyskiwanych w warunkach in vitro, co może stanowić również cenną wiedze dla embriologów pracujących nie tylko we wspomaganym rozrodzie człowieka, ale również w rozrodzie zwierząt hodowlanych (głównie bydła), co samo w sobie posiada duży potencjał aplikacyjny.
Abstract (EN)
Mitochondria (mt), are highly dynamic organelles that have evolved a symbiotic relationship with the eukaryotic cells, with a prime function of ATP synthesis via the oxidative phosphorylation (OXPHOS). The initial stages of mammalian development rely on substantial remodelling, from transcriptional and epigenetic networks that control gene expression, through cytoskeletal organisation that determines cell shape and intracellular environment, to signalling pathways that govern cell fate. Following fertilisation, a gradual shift from toti- towards pluri- and multi- potency is observed. As a result, a blastocyst is formed. For the first time in development two distinct cell lineages appear, the inner cell mass (ICM) and the trophectoderm (TE). Although a lot is known about molecular and spatio-temporal mechanisms regulating these processes, the role of organelles is often narrowed to their principal functions such as, energy production in case of mt. Indeed, mammalian embryogenesis, and the preceding events - gamete formation and fertilisation require high amount for energy. Mt also play a regulatory role in numerus other processes fundamental for cell function, like: organic compound biosynthesis, regulation of apoptosis, calcium homeostasis and stress response. As by-product, OXPHOS releases most of the endogenous reactive oxygen species (ROS), which are implicated in signalling and gene expr. regulation. All these processes build up, what we define as developmental potential of an embryo. Number and activity of mt contained within the oocyte, correlate with its ability to generate a viable embryo after fertilisation. Perturbations and deficits in mt function manifest not only as reduced oocyte and embryo quality, but contribute to post-implantation failure and adult disease. A growing body of evidence indicates that altered availability of metabolic co-factors modulate the activity of epigenetic modifiers, such that oocyte and embryo mt activity have the capacity to establish long-lasting alterations to the epigenetic landscape. Recent studies done on yeast and HeLa cells suggest that mt dynamics may be one of the key elements of meiotic progression, securing proper chromatid separation and genomic stability.
Mitochondrion, with its broad spectrum of regulatory functions lies at the centre of developmental progression. Still many aspects of these interactions need to be clarified, mostly at the molecular level (signalling) and in cytokinesis. The project hypothesis revolves around the role of mt in securing developmental success of the mammalian embryo. Studies will be done on bovine oocytes and in vitro obtained embryos, as cattle is recognised as a good model to mammalian embryogenesis. The project aims to perform a multidimensional study that will allow to link mt spatiotemporal distribution, activity, signalling and cytoskeleton interactions with events crucial for the progression of mammalian preimplantation development, such as chromosomal stability, embryonic genome activation and first cell fate decisions leading to the ICM/TE specification. The experiment will be run on two levels, cytogenetic (addressing mt-cytoskeleton interactions, genomic stability) and molecular, directed at linking mt activity with transcriptional landscape and signalling leading to embryonic cell differentiation. The experimental plan is based on two experimental groups of embryos (1) obtained under standard embryo culture conditions, and (2) subjected to oxidative stress during culture. This will allow to create an environment to investigate the influence of mt activity on embryonic development. The experimental methods will include (1) analysis of mt activity and distribution pattern, using life imaging and Super-resolution confocal and Stimulated Emission Depletion (STED) microscopy, (2) cytogenetic studies to investigate the role of mt in maintaining genomic stability, which will be facilitated by preimplantation genetic testing for aneuploidy (PGT-A) and validated by classical cytogenetic methodology (3D-FISH) with probes specific to bovine chromosomes, as no NGS-based PGT-A platforms dedicated to cattle exist. Also a novel approach will be taken to estimate chromosome copy number by droplet digital PCR (ddPCR). (3) These studies will be facilitated by single cell RNA-seq analysis, evaluation of mtDNA methylation and investigation of the role ROS in regulation of differentiation inducing signalling.
Mitochondrion, with its broad spectrum of regulatory functions lies at the centre of developmental progression. Still many aspects of these interactions need to be clarified, mostly at the molecular level (signalling) and in cytokinesis. The project hypothesis revolves around the role of mt in securing developmental success of the mammalian embryo. Studies will be done on bovine oocytes and in vitro obtained embryos, as cattle is recognised as a good model to mammalian embryogenesis. The project aims to perform a multidimensional study that will allow to link mt spatiotemporal distribution, activity, signalling and cytoskeleton interactions with events crucial for the progression of mammalian preimplantation development, such as chromosomal stability, embryonic genome activation and first cell fate decisions leading to the ICM/TE specification. The experiment will be run on two levels, cytogenetic (addressing mt-cytoskeleton interactions, genomic stability) and molecular, directed at linking mt activity with transcriptional landscape and signalling leading to embryonic cell differentiation. The experimental plan is based on two experimental groups of embryos (1) obtained under standard embryo culture conditions, and (2) subjected to oxidative stress during culture. This will allow to create an environment to investigate the influence of mt activity on embryonic development. The experimental methods will include (1) analysis of mt activity and distribution pattern, using life imaging and Super-resolution confocal and Stimulated Emission Depletion (STED) microscopy, (2) cytogenetic studies to investigate the role of mt in maintaining genomic stability, which will be facilitated by preimplantation genetic testing for aneuploidy (PGT-A) and validated by classical cytogenetic methodology (3D-FISH) with probes specific to bovine chromosomes, as no NGS-based PGT-A platforms dedicated to cattle exist. Also a novel approach will be taken to estimate chromosome copy number by droplet digital PCR (ddPCR). (3) These studies will be facilitated by single cell RNA-seq analysis, evaluation of mtDNA methylation and investigation of the role ROS in regulation of differentiation inducing signalling.