Czynniki transkrypcyjne jako narzędzia masowego działania w ulepszaniu cech przemysłowych u drożdży

Białka pozyskiwane na drodze mikrobiologicznej produkcji znajdują szerokie zastosowanie jako leki,
szczepionki, komponenty testów diagnostycznych, w produkcji żywności, środków piorących, czyszczących,
kosmetyków, a także w przetwórstwie odpadowej biomasy. Podczas procesu produkcji, komórki
mikrobiologicznego producenta są narażone na rozliczne czynniki stresowe, powodowane zarówno przez warunki
zewnętrzne, jak i wewnętrzne ograniczenia, powstałe na skutek wymuszonego przekierowania metabolizmu w
pożądanym przez człowieka kierunku. Wysoki potencjał do produkcji pożądanego białka w trakcie bioprocesu jest
wypadkową wielu czynników, a w tym - wydajnością komórkowej maszynerii produkcji białek (translacyjno_x0002_sekrecyjnej) oraz odpornością komórek producenta na pojawiające się stresy środowiskowe.
Zarówno wysoce sprawna maszyneria translacyjno-sekrecyjna, jak i odporność na czynniki stresowe to
cechy złożone, które zależą od prawidłowego i skoordynowanego działania wielu procesów w komórce, za które
odpowiadają liczne geny i białka. Złożony charakter tych cech powoduje, że próby ich ulepszania stanowią
poważne wyzwanie, jako że trudno jest precyzyjnie wskazać warunkujące je elementy (poszczególne geny, ich
kombinacje czy procesy). Modyfikacja jednego czy kilku genów jest często kompensowana przez naturalne
mechanizmy komórkowe dążące do zachowania homeostazy. Z tego względu uważa się, że w przypadku
modyfikacji cech złożonych, rozsądnym rozwiązaniem są jedynie podejścia globalne, pozwalające na
wprowadzanie licznych, wielokierunkowych („masowych”) zmian. Tradycyjnie takie modyfikacje wprowadzano
losowo, od czego się obecnie odchodzi przez wzgląd na brak kontroli nad przebiegiem procesu ulepszania. Jednym
z nowatorskich rozwiązań jest wywoływanie masowych zmian w funkcjonowaniu komórki poprzez kontrolowane
manipulacje czynnikami transkrypcyjnymi. Czynniki transkrypcyjne (TFs) to wewnątrzkomórkowe elementy
białkowe zawiadujące ekspresją genów w odpowiedzi na bodźce pochodzące z zewnątrz / wewnątrz komórki,
powodujące masowe zmiany w funkcjonowaniu komórki. Warto podkreślić, że odpowiedź komórki wywołana na
skutek działania danego TF jest skoordynowana, adekwatna i ukierunkowana, co oznacza, że modulacji podlegają
rozliczne i pozornie niepowiązane ze sobą elementy molekularne (przykładowo: metabolizm energetyczny,
funkcjonowanie błon komórkowych i metabolizm aminokwasów), które w efekcie powodują kompleksową i
możliwie najskuteczniejszą odpowiedź na dany bodziec, jaką komórka może wygenerować.
W niniejszym projekcie planuje się wskazać TFs przyczyniające się do zwiększonej odporności komórek
mikroorganizmów na czynniki stresowe typowo zaistniałe w warunkach procesów biotechnologicznej produkcji,
oraz/lub umożliwiające zwiększoną produkcję wartościowych białek, które dalej mogą być stosowane w
rozmaitych dziedzinach działalności człowieka. Badania będą prowadzone z wykorzystaniem drożdży Yarrowia
lipolytica. Y. lipolytica to bezpieczny gatunek drożdży niekonwencjonalnych (status GRAS wydany przez FDA i
EFSA) obecnie szeroko stosowany w badaniach naukowych i w praktyce przemysłowej m.in. do produkcji pasz
(dla koni i bydła), białek (np. lipaza, proteaza), kwas(k)u cytrynowego, czy naturalnego, bezkalorycznego słodzika
(erytrytolu). Większość TFs w Y. lipolytica została zidentyfikowana dopiero niedawno, na podstawie skanowania
całkowitego sekretomu z wykorzystaniem narzędzi bioinformatycznych, lecz ich funkcja molekularna pozostaje
nadal nieznana.
Planuje się przeprowadzić prace eksperymentalne z wykorzystaniem biblioteki 125 rekombinowanych
szczepów Y. lipolytica, w których geny kodujące nowo-zidentyfikowane TFs zostaną poddane nadekspresji wraz
z łatwo-wykrywalnymi białkami reporterowymi. Biblioteka ta zostanie poddana intensywnemu skriningowi w
rozmaitych warunkach (także stresowych) celem wskazania TFs odpowiadających na zadany czynnik
środowiskowy. Zaprojektowany plan eksperyemtnalny obejmuje 78 różnych wariantów hodowli. Warunki (w tym
stresowe) zostały wybrane na podstawie ich znanego wpływu na wzrost i aktywność metaboliczną Y. lipolytica
oraz innych, spokrewnionych gatunków, adekwatności do procesów produkcyjnych, oraz ich znanej interakcji z
efektywnością produkcji białek. Planuje się badać, czy manipulacja TFs spowoduje, że komórki będą mogły
wzrastać i zachować żywotność w warunkach niekorzystnych, np. obniżonej dostępności tlenu, nieoptymalnej
dostępności składników pokarmowych, kwaśnym pH czy przy zmianie temperatury. Pogłębione badania planuje
się przeprowadzić z TFs, których nadekspresja umożliwia komórkom Y. lipolytica produkcję białek pomimo
zaistnienia niekorzystnych warunków środowiskowych.
W badaniach zostaną wykorzystane nowoczesne metody pozwalające na prowadzenie wielu hodowli i
analiz równolegle. Badania zostaną przeprowadzone z wykorzystaniem nowatorskich technik i rozwiązań, tj.
klonowanie modularne GoldenGate, edycja genomu CRISPR-Cas9, zminiaturyzowane, wysokoprzepustowe
techniki hodowli, transformacji i oznaczeń biochemicznych. Charakterystyka regulomów (genów podległych)
wybranych TF zostanie przeprowadzona z wykorzystaniem kompleksowych technik omicznych (RNAseq) i
ciągłych hodowli bioreaktorowych w warunkach stanu-ustalonego.
Wyniki projektu pozwolą na zdobycie wiedzy podstawowej o znacznym potencjale aplikacyjnym.
Przewiduje się zdobycie nowej wiedzy na temat molekularnych podstaw działania komórek, tj. niepoznanych TF,
ich funkcji, mechanizmów działania i roli w kształtowaniu biotechnologicznie istotnych cech

oraz wskazanie
nowych strategii inżynierii genetycznej o istotnym wpływie na badania podstawowe i aplikacyjne. Według
najlepszej wiedzy zespołu badawczego, tak szeroko-zakrojone, kompleksowe badania nad wpływem TF na
produkcję heterologicznych białek w powiązaniu z działaniem czynników stresowych nie zostały dotychczas
przeprowadzone dla Y. lipolytica, ani innych gatunków drożdży