Analiza transkryptomu i charakterystyka fizjologiczna szczepów Pseudomonos aeruginosa wyizolowanych z ryb
Type
Project
Date Issued
2021
Author
Natalia Małgorzata Tomaś
Discipline
food and nutrition technology
Abstract (PL)
Obecnie odnotowuje się wzrost konsumpcji żywności pochodzenia morskiego należących do grupy
produktów gotowych do spożycia. Głównie jest to spowodowane ich pozytywnym wpływem na zdrowie
produktów gotowych do spożycia. Głównie jest to spowodowane ich pozytywnym wpływem na zdrowie
powyższe produkty są źródłem wysoko strawnego białka, wielonienasyconych kwasów tłuszczowych,
należących do rodziny omega-3 oraz jodu, cynku, wapnia czy witaminy D. Konsekwencją zwiększonej
konsumpcji ryb jest intensyfikacja ich hodowli, którą osiągnięto poprzez prewencyjne podawanie
antybiotyków. Najbardziej rozpowszechnionym i dostępnym w handlu gatunkiem ryb jest łosoś atlantycki,
który poddany procedurze wędzenia na zimno, należy do produktów gotowych do spożycia. W tej
technologii efekt trwałości konsumpcyjnej wyrobu jest głównie osiągany poprzez dodatek soli, usuwanie
wody, wędzenie, a czasem pakowanie w modyfikowanej atmosferze o obniżonej zawartości tlenu. Jednak ze
względu na obecne trendy związane głównie z ograniczeniem zawartości soli w żywności, powszechne staje
się występowanie drobnoustrojów chorobotwórczych w produktach pochodzenia morskiego.
Biorąc pod uwagę wysokie ryzyko obecności niepożądanej mikroflory w minimalnie przetworzonych
produktach na bazie ryb, przeprowadziliśmy wstępne badania w celu oszacowania ich jakości
mikrobiologicznej. Pośród specyficznej mikroflory psującej powyższe wyroby, dominującym gatunkiem był
Pseudomonas aeruginosa. Jest to Gram-ujemna bakteria o zróżnicowanych zdolnościach adaptacyjnych,
warunkujących przetrwanie komórek w ekosystemie żywności. Jest to również drobnoustrój
oportunistycznie chorobotwórczy, wywołujący ostre i chroniczne infekcje poprzez syntezę licznych
czynników wirulencji, regulowanych systemem quorum sensing. Problemy zdrowotne u konsumentów
spowodowanych spożyciem zanieczyszczonych Pseudomonas aeruginosa ryb szacuje się na poziomie
11.5% w Europie i 17% w krajach rozwijających się. Z tego powodu konieczne staje się opracowanie
skutecznych metod zabezpieczania żywności pochodzenia morskiego przed pałeczkami Pseudomonas
aeruginosa, a także przeprowadzenie ich dogłębnej charakterystyki. Odnotowuje się również potrzebę
przeprowadzenia badań, oceniających wpływ alternatywnych środków przeciwdrobnoustrojowych, które
można wprowadzić w technologii minimalnego przetwarzania na fizjologię bakterii i ocenę potencjalnego
mechanizmu oporności bakterii na zastosowane czynniki. W celu kompleksowego oszacowania tych zmian
kluczowe znaczenie ma wykorzystanie analizy transkryptomu.
Głównym celem projektu będzie analiza transkryptomu i odpowiedzi fizjologicznej izolatów
Pseudomonas aeruginosa na wybrane stężenia alternatywnych środków przeciwdrobnoustrojowych, które
można zastosować w technologii minimalnego przetwarzania żywności pochodzenia morskiego - chlorek
potasu (KCl) i sole sodowe kwasów organicznych - mleczan sodu (NaL), cytrynian sodu (NaC) i octan sodu
(NaA). Hodowle drobnoustrojów prowadzone będą w warunkach mikroaerofilnych symulujących atmosferę
modyfikowaną produktu. Ponieważ Pseudomonas aeruginosa jest drobnoustrojem, który może być
przenoszony przez żywność, w pierwszym etapie badań zostanie oceniona faktyczna oporność na antybiotyki
wszystkich badanych szczepów. Następnie, po potraktowaniu komórek wybranymi stężeniami
alternatywnych środków przeciwdrobnoustrojowych, zdolność do przeżycia i żywotność komórek będą
badane techniką cytometrii przepływowej, która skanuje hodowlę „komórka po komórce”. Powyższa analiza
zagwarantuje selekcję najbardziej opornych/wrażliwych szczepów, które poddane zostaną analizie
transkryptomu. Zagwarantuje to wgląd w zestaw genów, które ulegają ekspresji i jak istotna jest odpowiedź
komórek na obecność danych stężeń środków przeciwdrobnoustrojowych i w warunki mikroaerofilne
hodowli. Poziomy ekspresji tych genów będą analizowane in vitro techniką ilościowej reakcji łańcuchowej
polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-qPCR). Dodatkowo przeprowadzenie eksperymentów in situ
scharakteryzuje aktywność metaboliczną Pseudomonas aeruginosa w ekosystemie żywności.
należących do rodziny omega-3 oraz jodu, cynku, wapnia czy witaminy D. Konsekwencją zwiększonej
konsumpcji ryb jest intensyfikacja ich hodowli, którą osiągnięto poprzez prewencyjne podawanie
antybiotyków. Najbardziej rozpowszechnionym i dostępnym w handlu gatunkiem ryb jest łosoś atlantycki,
który poddany procedurze wędzenia na zimno, należy do produktów gotowych do spożycia. W tej
technologii efekt trwałości konsumpcyjnej wyrobu jest głównie osiągany poprzez dodatek soli, usuwanie
wody, wędzenie, a czasem pakowanie w modyfikowanej atmosferze o obniżonej zawartości tlenu. Jednak ze
względu na obecne trendy związane głównie z ograniczeniem zawartości soli w żywności, powszechne staje
się występowanie drobnoustrojów chorobotwórczych w produktach pochodzenia morskiego.
Biorąc pod uwagę wysokie ryzyko obecności niepożądanej mikroflory w minimalnie przetworzonych
produktach na bazie ryb, przeprowadziliśmy wstępne badania w celu oszacowania ich jakości
mikrobiologicznej. Pośród specyficznej mikroflory psującej powyższe wyroby, dominującym gatunkiem był
Pseudomonas aeruginosa. Jest to Gram-ujemna bakteria o zróżnicowanych zdolnościach adaptacyjnych,
warunkujących przetrwanie komórek w ekosystemie żywności. Jest to również drobnoustrój
oportunistycznie chorobotwórczy, wywołujący ostre i chroniczne infekcje poprzez syntezę licznych
czynników wirulencji, regulowanych systemem quorum sensing. Problemy zdrowotne u konsumentów
spowodowanych spożyciem zanieczyszczonych Pseudomonas aeruginosa ryb szacuje się na poziomie
11.5% w Europie i 17% w krajach rozwijających się. Z tego powodu konieczne staje się opracowanie
skutecznych metod zabezpieczania żywności pochodzenia morskiego przed pałeczkami Pseudomonas
aeruginosa, a także przeprowadzenie ich dogłębnej charakterystyki. Odnotowuje się również potrzebę
przeprowadzenia badań, oceniających wpływ alternatywnych środków przeciwdrobnoustrojowych, które
można wprowadzić w technologii minimalnego przetwarzania na fizjologię bakterii i ocenę potencjalnego
mechanizmu oporności bakterii na zastosowane czynniki. W celu kompleksowego oszacowania tych zmian
kluczowe znaczenie ma wykorzystanie analizy transkryptomu.
Głównym celem projektu będzie analiza transkryptomu i odpowiedzi fizjologicznej izolatów
Pseudomonas aeruginosa na wybrane stężenia alternatywnych środków przeciwdrobnoustrojowych, które
można zastosować w technologii minimalnego przetwarzania żywności pochodzenia morskiego - chlorek
potasu (KCl) i sole sodowe kwasów organicznych - mleczan sodu (NaL), cytrynian sodu (NaC) i octan sodu
(NaA). Hodowle drobnoustrojów prowadzone będą w warunkach mikroaerofilnych symulujących atmosferę
modyfikowaną produktu. Ponieważ Pseudomonas aeruginosa jest drobnoustrojem, który może być
przenoszony przez żywność, w pierwszym etapie badań zostanie oceniona faktyczna oporność na antybiotyki
wszystkich badanych szczepów. Następnie, po potraktowaniu komórek wybranymi stężeniami
alternatywnych środków przeciwdrobnoustrojowych, zdolność do przeżycia i żywotność komórek będą
badane techniką cytometrii przepływowej, która skanuje hodowlę „komórka po komórce”. Powyższa analiza
zagwarantuje selekcję najbardziej opornych/wrażliwych szczepów, które poddane zostaną analizie
transkryptomu. Zagwarantuje to wgląd w zestaw genów, które ulegają ekspresji i jak istotna jest odpowiedź
komórek na obecność danych stężeń środków przeciwdrobnoustrojowych i w warunki mikroaerofilne
hodowli. Poziomy ekspresji tych genów będą analizowane in vitro techniką ilościowej reakcji łańcuchowej
polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-qPCR). Dodatkowo przeprowadzenie eksperymentów in situ
scharakteryzuje aktywność metaboliczną Pseudomonas aeruginosa w ekosystemie żywności.
Abstract (EN)
1. The aim of researches/research hypothesis
The global consumption of seafoods is constantly growing. This phenomenon is associated with documented
positive effects of that product in prevention of cardiovascular diseases. Cold-smoked salmon is an example
of minimally preserved fish product, which is contaminated by microflora, mostly by bacterial psychrotrophs
(mostly belonging to Pseudomonadaceae family), causing gastrointestinal diseases, and/or changing the
sensory properties of the product, rendering it unsuitable for consumption In the cold smoke technology, the
preservative effect is associated only with lowering the water activity by salting, dehydrating and smoking
contribute to the preservative effects. However, due to current trends minimizing the salt content within the
product to the level of <6% NaCl (w/w) in the water phase, the occurrence of microbiological hazards,
especially Pseudomonas aeruginosa strains in seafoods are common, being itself the great challenge that
microbiologists and food producers are facing at the moment (Løvdal, 2015). Taking these factors into
considerations, additional/alternative preservatives in regard to Pseudomonas aeruginosa, maintaining
the quality of fish-based products are needed. To the group of potential preservative agents, that can be
implemented in minimally processing technology of seafoods are potassium chloride (KCl) and sodium salts
of organic acids (e.g. sodium lactate (NaL), sodium citrate (NaC), sodium acetate (NaA)) (Ghaly et al., 2010
The global consumption of seafoods is constantly growing. This phenomenon is associated with documented
positive effects of that product in prevention of cardiovascular diseases. Cold-smoked salmon is an example
of minimally preserved fish product, which is contaminated by microflora, mostly by bacterial psychrotrophs
(mostly belonging to Pseudomonadaceae family), causing gastrointestinal diseases, and/or changing the
sensory properties of the product, rendering it unsuitable for consumption In the cold smoke technology, the
preservative effect is associated only with lowering the water activity by salting, dehydrating and smoking
contribute to the preservative effects. However, due to current trends minimizing the salt content within the
product to the level of <6% NaCl (w/w) in the water phase, the occurrence of microbiological hazards,
especially Pseudomonas aeruginosa strains in seafoods are common, being itself the great challenge that
microbiologists and food producers are facing at the moment (Løvdal, 2015). Taking these factors into
considerations, additional/alternative preservatives in regard to Pseudomonas aeruginosa, maintaining
the quality of fish-based products are needed. To the group of potential preservative agents, that can be
implemented in minimally processing technology of seafoods are potassium chloride (KCl) and sodium salts
of organic acids (e.g. sodium lactate (NaL), sodium citrate (NaC), sodium acetate (NaA)) (Ghaly et al., 2010
Almli and Hersleth, 2012). However, detailed investigations of their influence on bacterial foodborne
psychrotrophs, especially Pseudomonas aeruginosa strains, have not been conducted to date.
In the project, we planned the innovative and multidirectional (microbiological, genetics and bioinformatics)
analysis to characterize the transcriptome and physiological response of Pseudomonas aeruginosa
isolates to selected concentrations of KCl/NaL/NaC/NaA. The bacteria will be cultured under
microaerophilic conditions.
The specific objectives of the project are: (i) preparation of stock cultures of Pseudomonas aeruginosa
strains and determination of their antibiotic resistance
psychrotrophs, especially Pseudomonas aeruginosa strains, have not been conducted to date.
In the project, we planned the innovative and multidirectional (microbiological, genetics and bioinformatics)
analysis to characterize the transcriptome and physiological response of Pseudomonas aeruginosa
isolates to selected concentrations of KCl/NaL/NaC/NaA. The bacteria will be cultured under
microaerophilic conditions.
The specific objectives of the project are: (i) preparation of stock cultures of Pseudomonas aeruginosa
strains and determination of their antibiotic resistance
(ii) estimation of the response of Pseudomonas
aeruginosa to selected concentrations of KCl/NaL/NaC/NaA and microaerophilic conditions
aeruginosa to selected concentrations of KCl/NaL/NaC/NaA and microaerophilic conditions
(iii) whole_x0002_transcriptomic analysis of Pseudomonas aeruginosa strains. The whole transcriptomic analysis will verify if
selected/biomarkers genes are truly expressed in examined cells upon treatment with selected antimicrobials
selected/biomarkers genes are truly expressed in examined cells upon treatment with selected antimicrobials
(iv) assessment of the expression level of genes involved in virulence and stress resistance mechanisms in
Pseudomonas aeruginosa cells in vitro and in situ experiments.
2. Research project methodology
In the project the wild type of Pseudomonas aeruginosa isolates will be used. The antibiotic resistance will
be evaluated by disk diffusion method. The physiological activities after exposition on selected alternative
antimicrobial agents will be investigated by the flow cytometry and the biomass build-up analysis. The
whole transcriptome analysis will be carried out using third generation sequencing method (RNA-seq) on
Illumina NGS platforms and MS-102-2002 MiSeq Reagents Kit v2. Bioinformatics tools using CLC
Genomics Workbench v 11.0.1 and CLC Microbial Genomics Module v 3.6.1 plugin (QIAGEN, USA) will
be used for transcriptome analysis. On the basis of selected genes sequences, the starters for RT-qPCR
analysis will be designed. Finally, the RT-qPCR analysis will evaluate the changes in expression levels of
genes encoding virulence factors, providing the antibiotics resistance (efflux transporter of multidrug) and
genes involved in stress tolerance and quorum sensing mechanism.
The influence of expected results on the development of science
The results are important primary because: (i) allow assessing antibiotic resistance among Pseudomonas
aeruginosa strains isolated from fish
Pseudomonas aeruginosa cells in vitro and in situ experiments.
2. Research project methodology
In the project the wild type of Pseudomonas aeruginosa isolates will be used. The antibiotic resistance will
be evaluated by disk diffusion method. The physiological activities after exposition on selected alternative
antimicrobial agents will be investigated by the flow cytometry and the biomass build-up analysis. The
whole transcriptome analysis will be carried out using third generation sequencing method (RNA-seq) on
Illumina NGS platforms and MS-102-2002 MiSeq Reagents Kit v2. Bioinformatics tools using CLC
Genomics Workbench v 11.0.1 and CLC Microbial Genomics Module v 3.6.1 plugin (QIAGEN, USA) will
be used for transcriptome analysis. On the basis of selected genes sequences, the starters for RT-qPCR
analysis will be designed. Finally, the RT-qPCR analysis will evaluate the changes in expression levels of
genes encoding virulence factors, providing the antibiotics resistance (efflux transporter of multidrug) and
genes involved in stress tolerance and quorum sensing mechanism.
The influence of expected results on the development of science
The results are important primary because: (i) allow assessing antibiotic resistance among Pseudomonas
aeruginosa strains isolated from fish
(ii) allow characterising the Pseudomonas aeruginosa growth and
metabolic activity after treatment with KCl/NaL/NaC/NaA that might be used in minimal processing
technology
metabolic activity after treatment with KCl/NaL/NaC/NaA that might be used in minimal processing
technology
(iii) allow defining the global foodborne pseudomonads response on applied conditions by
transcriptomic analysis
transcriptomic analysis
and (iv) examine the changes in key gene expression levels in Pseudomonas
aeruginosa cells after treating with selected alternative preservatives in vitro and in situ experiments.
aeruginosa cells after treating with selected alternative preservatives in vitro and in situ experiments.