Rola neuropeptydu B w regulacji funkcji preadipocytów szczura i świni
Type
Project
Date Issued
2017
Author
Discipline
animal science and fisheries
veterinary science
Abstract (PL)
Neuropeptyd B (NPB) moduluje apetyt, interakcje społeczne, ból i emocje na drodze aktywowania dwóch sprzężonych z białkiem G-receptorów określanych jako NPBW1 (GPR7) i NPBW2 (GPR8). U zwierząt niedobór NPB i NPBW1 prowadzi do otyłości i zaburzeń metabolizmu tlenowego, podczas gdy aktywacja receptora NPBW1 chroni przed otyłością. Ostatnie badania pokazują, że NPB kontroluje metabolizm lipidowy i endokrynne funkcje zróżnicowanych adipocytów szczura. Nasze wstępne badania wykazały, że NPBW1 ulega ekspresji w preadipocytach jednak rola NPB w tych komórkach jest zupełnie nieznana. Celem tego projektu jest scharakteryzowanie roli NPB w kontroli proliferacji, apoptozy i różnicowaniu białych i brunatnych preadipocytów szczura i świni. Ponadto, będzie rozpatrywany mechanizm dokomórkowej transdukcji sygnału odpowiadający za efekty NPB w preadipocytach. Na podstawie literatury i naszych wstępnych wyników (ekspresja NPBW1 w białych i brązowych preadipocytach oraz wzrost markerów różnicowania pod wpływem NPB w białych i brunatnych preadipocytach) stawiamy hipotezę, że NPB kontroluje proliferację, apoptozę i różnicowanie preadipocytów.
Eksperymenty będą wykorzystywać świeżo wyizolowane białe i brązowe preadipocyty szczura i świni poddawane następnie hodowli in vitro.
Rola neuropeptydu B w regulacji proliferacji komórek będzie oceniana przez kwantyfikację inkorporacji bromodeoksyurydyny (BrdU) a przeżywalność komórek w obecności NPB będzie analizowana z użyciem testu MTT. Apoptoza zostanie oceniona przez ilościowy pomiar mono-i oligonucleosomów we frakcji cytoplazmatycznej oraz produkję aktywnej kaspazy 3 metodą Western blot. Rola NBP w regulacji kluczowych dla adipogenezy białych i brązowych komórek tkanki tłuszczowej czynników transkrypcyjnych (PREF1, PPAR, C/EBPα, C/EBPβ, PRDM16, HOXC8, PGC-1α) i białek (GLUT4, FABP4, leptyny, UCP1) będzie mierzona za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) i/lub Western blot. Wydzielanie leptyny będzie oceniane z zastosowaniem testu immunoadsorpcyjnego (ELISA). Efekty działania NPB na metabolizm lipidów (akumulacji triacylogliceroli, wydzielania glicerolu) będzie analizowany przy użyciu zestawów handlowych. Sygnalizację wewnątrzkomórkową będącą efektem działania NPB w preadypocytach oceniać będziemy na podstawie zmian w fosforylacji ERK1/2, p38 oraz kinazy białkowej B (PKB), stosując technikę Western blot. Wpływ NBP na syntezę cAMP zostanie oceniony za pomocą testu ELISA. W celu określenia roli ERK1/2, p38, PKB i cAMP odpowiadających za efekty działania NPB na proliferację, różnicowanie i apoptozę białych i brunatnych preadypocytów będą zastosowane specyficzne farmakologiczne inhibitory wymienionych powyżej człynników wewnątrzkomórkowych kaskad sygnalizacyjnych.
Wyniki tego projektu przyczynią się do poprawy naszego zrozumienia roli neuropeptydu B i jego receptora NPBW1 w funkcjonowaniu białych i brunatnych preadypocytów. Ponadto, pozwolą na wyjaśnienie wewnątrzkomórkowych mechanizmów odpowiadających za efekty NPB na proliferację, apoptozę i różnicowanie preadypocytów. Lepsze zrozumienie różnicowania i proliferacji predipocytów w kierunku powstania dojrzałych komórek tłuszczowych jest ważne w świetle obecnej wiedzy patofizjologii otyłości i cukrzycy typu 2 oraz może być cenne dla rozwoju nowych narzędzi molekularnych w hodowli i żywieniu zwierząt.
Eksperymenty będą wykorzystywać świeżo wyizolowane białe i brązowe preadipocyty szczura i świni poddawane następnie hodowli in vitro.
Rola neuropeptydu B w regulacji proliferacji komórek będzie oceniana przez kwantyfikację inkorporacji bromodeoksyurydyny (BrdU) a przeżywalność komórek w obecności NPB będzie analizowana z użyciem testu MTT. Apoptoza zostanie oceniona przez ilościowy pomiar mono-i oligonucleosomów we frakcji cytoplazmatycznej oraz produkję aktywnej kaspazy 3 metodą Western blot. Rola NBP w regulacji kluczowych dla adipogenezy białych i brązowych komórek tkanki tłuszczowej czynników transkrypcyjnych (PREF1, PPAR, C/EBPα, C/EBPβ, PRDM16, HOXC8, PGC-1α) i białek (GLUT4, FABP4, leptyny, UCP1) będzie mierzona za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) i/lub Western blot. Wydzielanie leptyny będzie oceniane z zastosowaniem testu immunoadsorpcyjnego (ELISA). Efekty działania NPB na metabolizm lipidów (akumulacji triacylogliceroli, wydzielania glicerolu) będzie analizowany przy użyciu zestawów handlowych. Sygnalizację wewnątrzkomórkową będącą efektem działania NPB w preadypocytach oceniać będziemy na podstawie zmian w fosforylacji ERK1/2, p38 oraz kinazy białkowej B (PKB), stosując technikę Western blot. Wpływ NBP na syntezę cAMP zostanie oceniony za pomocą testu ELISA. W celu określenia roli ERK1/2, p38, PKB i cAMP odpowiadających za efekty działania NPB na proliferację, różnicowanie i apoptozę białych i brunatnych preadypocytów będą zastosowane specyficzne farmakologiczne inhibitory wymienionych powyżej człynników wewnątrzkomórkowych kaskad sygnalizacyjnych.
Wyniki tego projektu przyczynią się do poprawy naszego zrozumienia roli neuropeptydu B i jego receptora NPBW1 w funkcjonowaniu białych i brunatnych preadypocytów. Ponadto, pozwolą na wyjaśnienie wewnątrzkomórkowych mechanizmów odpowiadających za efekty NPB na proliferację, apoptozę i różnicowanie preadypocytów. Lepsze zrozumienie różnicowania i proliferacji predipocytów w kierunku powstania dojrzałych komórek tłuszczowych jest ważne w świetle obecnej wiedzy patofizjologii otyłości i cukrzycy typu 2 oraz może być cenne dla rozwoju nowych narzędzi molekularnych w hodowli i żywieniu zwierząt.
Abstract (EN)
Neuropeptide B (NPB) modulates appetite, social interaction, pain and emotions by activating two G-protein coupled receptors termed as NPBW1 (GPR7) and NPBW2 (GPR8) receptors. In animals NPB and NPBW1 deficiency results in obesity and impaired oxidative metabolism, whereas activation of NPBW1 receptor protects again obesity. A recent study show that NPB control lipid metabolism and endocrine functions of differentiated rat primary adipocytes. Our preliminary data showed that NPBW1 is expressed in preadipocytes, however the role of NPB in these cells is completely unknown. The aim of this project is to characterize the role on NPB in controlling white and brown rat and porcine preadipocytes proliferation, apoptosis and differentiation. In addition, cellular mechanism of signailling conferring the effects of NPB in preadipocytes will be investigated. Based on literature and our preliminary data (expression of NPBW1 in white and brown preadipocytes and NPB-mediated increase of differentation markers in white and brown preadipocytes) we hypothesize that NPB controls their proliferation, apoptosis and differentiation.
The experiments will utilize freshly isolated rat and porcine white and brown preadipocytes cultured in vitro.
The role of NPB in regulating cell proliferation will be assessed by quantification of bromodeoxyuridine (BrdU) incorporation and the viability of the cells in presences of NPB will be analysed using MTT. Apoptosis will be assessed by quantification of mono- and oligonucleosomes in the cytoplasmic fraction and Western blot evaluation of active caspase 3 production. The role of NPB in regulating crucial for white and brown adipogenesis transcription factors (PREF1, PPARγ, C/EBPα, C/EBPβ, PRDM16, HOXC8, PGC-1α) and proteins (GLUT4, FABP4, leptin, UCP1) will be will be measured by quantitative real-time PCR (qPCR) and Western blot. Leptin secretion will be evaluated by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The effects of NPB on lipid metabolism (triacylglycerol accumulation, glycerol secretion) will be analyzed using commercial kits. The molecular signaling conferring the effects of NPB in preadipocytes will be assessed be evaluation of changes in phosphorylation of ERK1/2, p38 and protein kinase B (PKB) using a Western blot technique. The effects of NPB and on cAMP synthesis, will be assessed by ELISA assay. To determine the role of ERK1/2, p38, PKB and cAMP in conferring the effects of NPB on the proliferation, apoptosis and differentiation of white and brown preadipocytes specific pharmacological inhibitors of the above named members of intracellular signaling cascades will be utilized.
The results of this project will improve our understanding of the role of neuropeptide B and it receptor NPBW1 in white and brown preadipocytes. Furthermore, the intracellular mechanisms of NPB-modulated proliferation, apoptosis and differentiation of preadipocytes will be clarify. A better understanding of predipocytes proliferation and differentiation into mature fat cells is important in the light of current knowledge of pathophysiolgy of obesity and type 2 diabetes and is may be valuable for the development of novel molecular tools of animal breeding and nutrition.
The experiments will utilize freshly isolated rat and porcine white and brown preadipocytes cultured in vitro.
The role of NPB in regulating cell proliferation will be assessed by quantification of bromodeoxyuridine (BrdU) incorporation and the viability of the cells in presences of NPB will be analysed using MTT. Apoptosis will be assessed by quantification of mono- and oligonucleosomes in the cytoplasmic fraction and Western blot evaluation of active caspase 3 production. The role of NPB in regulating crucial for white and brown adipogenesis transcription factors (PREF1, PPARγ, C/EBPα, C/EBPβ, PRDM16, HOXC8, PGC-1α) and proteins (GLUT4, FABP4, leptin, UCP1) will be will be measured by quantitative real-time PCR (qPCR) and Western blot. Leptin secretion will be evaluated by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The effects of NPB on lipid metabolism (triacylglycerol accumulation, glycerol secretion) will be analyzed using commercial kits. The molecular signaling conferring the effects of NPB in preadipocytes will be assessed be evaluation of changes in phosphorylation of ERK1/2, p38 and protein kinase B (PKB) using a Western blot technique. The effects of NPB and on cAMP synthesis, will be assessed by ELISA assay. To determine the role of ERK1/2, p38, PKB and cAMP in conferring the effects of NPB on the proliferation, apoptosis and differentiation of white and brown preadipocytes specific pharmacological inhibitors of the above named members of intracellular signaling cascades will be utilized.
The results of this project will improve our understanding of the role of neuropeptide B and it receptor NPBW1 in white and brown preadipocytes. Furthermore, the intracellular mechanisms of NPB-modulated proliferation, apoptosis and differentiation of preadipocytes will be clarify. A better understanding of predipocytes proliferation and differentiation into mature fat cells is important in the light of current knowledge of pathophysiolgy of obesity and type 2 diabetes and is may be valuable for the development of novel molecular tools of animal breeding and nutrition.
Subject (pl)