Enzymatyczna hydroliza celulozy - poszukiwanie nowych kompleksów celulaz
Type
Project
Date Issued
2015
Author
Discipline
forestry
Abstract (PL)
Celem badań było poznanie mechanizmu i kinetyki procesu hydrolizy celulozy z wykorzystaniem enzymów celulolitycznych pozyskiwanych z wybranych gatunków owadów. Ponadto projekt miał na celu zweryfikowanie postawionych hipotez i wyjaśnienie czy kompleksy celulaz pozyskiwanych w obrębie różnych gatunków oraz różnych stadiów rozwojowych (larwy, imago) posiadają odmienny profil składu i aktywności enzymów. Czy celulolityczne enzymy występujące w przewodzie pokarmowym owadów wykazują większe powinowactwo do celulozy niż enzymy pozyskiwane z grzybów? A także w jakim stopniu enzymy pozyskiwane z owadów wpływają na zmiany strukturalne celulozy w tym między innymi na krystaliczność, stopień polimeryzacji, rozmiary krystalitów?
Uzyskane rezultaty pozwoliły wytypować najbardziej efektywny układ enzymatyczny, hydrolizujący celulozę.
W badaniach wykorzystano kompleks enzymów celulolitycznych pozyskiwany z czterech gatunków owadów, w tym dwóch produkujących endocelulazy oraz dwóch z układem mieszanym posiadających endo- i egzocelulazy. Materiał do badań pochodził z hodowli owadów prowadzonej w stałej temperaturze 28oC przy fotoperiodzie 12:12 h/h (dzień i noc). Przed przystąpieniem do oznaczenia aktywności enzymów w ekstraktach oznaczono poziom białka z wykorzystaniem metody kolorymetrycznej z kwasem bicynchoninowym (BCA), następnie wykonano analizę aktywności enzymów wykorzystując metodę z kwasem 3,5-dinitrosalicylowym (DNSA) oraz analizę zymograficzną.
Efektywność wyizolowanych kompleksów celulolitycznych badano w procesach hydrolizy celulozy, której źródłem były zróżnicowane materiały: paski bibuły filtracyjnej Whatman No 1, celuloza mikrokrystaliczna, karboksymetyloceluloza oraz celuloza in situ w układzie lignocelulozowym. Produkty biodegradacji celulozy oznaczane były metodą kolorymetryczną, pozwalającą określić stężenie cukrów redukujących w przeliczeniu na glukozę oraz metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z detekcją RI (HPLC/RI), która umożliwia określenie stężenia końcowych produktów hydrolizy (w tym głównie celobiozy i glukozy).
Na tej podstawie oznaczono aktywność enzymów (przy czym 1 jednostka aktywności enzymu to 1M cukru redukującego uwalnianego w ciągu minuty, w przeliczeniu na ilość oznaczonego białka w ekstrakcie enzymowym) oraz zweryfikowano, który układ jest najbardziej efektywny.
W badaniach uwzględniono bardzo szczegółową analizę strukturalną celulozy poddanej procesie biokonwersji, w tym analizę stopnia krystaliczności metodą spektroskopii w podczerwieni FTIR, analizę struktury nadcząsteczkowej polimeru metodą dyfrakcji promieni X. Wykonano także analizę stopnia polimeryzacji z wykorzystaniem metody chromatografii żelowej GPC oraz metody wiskozymetrycznej. Ponadto dla wyjaśnienia zmian strukturalnych przeprowadzono analizę spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR).
Uzyskane wyniki badań i ich kompleksowa analiza stanowią poszerzenie wiedzy na temat celulolitycznego rozkładu celulozy i układów lignocelulozowych pod wpływem działania enzymów. Obecnie wykorzystywane enzymy pochodzące z grzybów i bakterii nie dają pożądanych rezultatów w związku z tym podjęte w projekcie badania nad, poszukiwaniem nowych źródeł biokatalizatorów jest istotne w aspekcie dalszego rozwoju wielu dziedzin nauki i technologii. Badania wpisują się w nurt poszukiwań nowych kompleksów celulolitycznych, w kierunku poszerzenia i wyjaśnienia stanu wiedzy dotyczącego procesu degradacji biomasy lignocelulozowej z wykorzystaniem różnych układów enzymatycznych.
Uzyskane rezultaty pozwoliły wytypować najbardziej efektywny układ enzymatyczny, hydrolizujący celulozę.
W badaniach wykorzystano kompleks enzymów celulolitycznych pozyskiwany z czterech gatunków owadów, w tym dwóch produkujących endocelulazy oraz dwóch z układem mieszanym posiadających endo- i egzocelulazy. Materiał do badań pochodził z hodowli owadów prowadzonej w stałej temperaturze 28oC przy fotoperiodzie 12:12 h/h (dzień i noc). Przed przystąpieniem do oznaczenia aktywności enzymów w ekstraktach oznaczono poziom białka z wykorzystaniem metody kolorymetrycznej z kwasem bicynchoninowym (BCA), następnie wykonano analizę aktywności enzymów wykorzystując metodę z kwasem 3,5-dinitrosalicylowym (DNSA) oraz analizę zymograficzną.
Efektywność wyizolowanych kompleksów celulolitycznych badano w procesach hydrolizy celulozy, której źródłem były zróżnicowane materiały: paski bibuły filtracyjnej Whatman No 1, celuloza mikrokrystaliczna, karboksymetyloceluloza oraz celuloza in situ w układzie lignocelulozowym. Produkty biodegradacji celulozy oznaczane były metodą kolorymetryczną, pozwalającą określić stężenie cukrów redukujących w przeliczeniu na glukozę oraz metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z detekcją RI (HPLC/RI), która umożliwia określenie stężenia końcowych produktów hydrolizy (w tym głównie celobiozy i glukozy).
Na tej podstawie oznaczono aktywność enzymów (przy czym 1 jednostka aktywności enzymu to 1M cukru redukującego uwalnianego w ciągu minuty, w przeliczeniu na ilość oznaczonego białka w ekstrakcie enzymowym) oraz zweryfikowano, który układ jest najbardziej efektywny.
W badaniach uwzględniono bardzo szczegółową analizę strukturalną celulozy poddanej procesie biokonwersji, w tym analizę stopnia krystaliczności metodą spektroskopii w podczerwieni FTIR, analizę struktury nadcząsteczkowej polimeru metodą dyfrakcji promieni X. Wykonano także analizę stopnia polimeryzacji z wykorzystaniem metody chromatografii żelowej GPC oraz metody wiskozymetrycznej. Ponadto dla wyjaśnienia zmian strukturalnych przeprowadzono analizę spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR).
Uzyskane wyniki badań i ich kompleksowa analiza stanowią poszerzenie wiedzy na temat celulolitycznego rozkładu celulozy i układów lignocelulozowych pod wpływem działania enzymów. Obecnie wykorzystywane enzymy pochodzące z grzybów i bakterii nie dają pożądanych rezultatów w związku z tym podjęte w projekcie badania nad, poszukiwaniem nowych źródeł biokatalizatorów jest istotne w aspekcie dalszego rozwoju wielu dziedzin nauki i technologii. Badania wpisują się w nurt poszukiwań nowych kompleksów celulolitycznych, w kierunku poszerzenia i wyjaśnienia stanu wiedzy dotyczącego procesu degradacji biomasy lignocelulozowej z wykorzystaniem różnych układów enzymatycznych.
Abstract (EN)
The aim of the research was to determine the mechanism and kinetics of hydrolysis of cellulose using cellulolytic enzymes collected from selected insect species.
In addition, the project aimed to verify the hypotheses and to clarify whether the cellulase complexes obtained from different species and different developmental stages (larvae, imagoes) have different profiles of the composition and activity of enzymes. Do cellulolytic enzymes found in the alimentary tract of insects exhibit greater affinity to cellulose than enzymes collected from fungi? And also to what extent the enzymes collected from insects affect the structural changes of cellulose, including, inter alia, crystallinity, degree of polymerization, size of crystallites?
The obtained results allowed to select the most effective enzyme system for cellulose hydrolysis. The study used a complex of cellulolytic enzymes collected from four species of insects, including two producing endocellulases and two with a mixed system having endo- and exocellulases. The material for the research came from an insect breeding farm run at a constant temperature of 28oC and at a photoperiod of 12:12 h / h (day and night). Prior to the determination of enzyme activity in the extracts, the protein level was assayed using the bicinchoninic acid (BCA) colorimetric method, then the enzyme activity analysis was performed using the 3,5-dinitrosalicylic acid (DNSA) method and zymographic analysis.
Efficacy of isolated cellulolytic complexes was examined in the cellulose hydrolysis processes, which source were various materials: Whatman No. 1 filter paper strips, microcrystalline cellulose, carboxymethyl cellulose and cellulose in situ in the lignocellulose system.
The cellulose biodegradation products were determined by a standard colorimetric method, which allowed to determine the concentration of reducing sugars in terms of glucose, and by the high-performance liquid chromatography method with RI detection (HPLC / RI), which makes it possible to determine the concentration of end products of hydrolysis (mainly cellobiose and glucose).
On this basis, the activity of enzymes was determined (where 1 unit of enzyme activity took into account 1M reducing sugar released per minute, based on the amount of assayed protein in the enzyme extract) and it was verified which system was the most effective.
The study included a very detailed structural analysis of cellulose subjected to the bioconversion process, including the analysis of the degree of crystallinity by means of FTIR infrared spectroscopy, analysis of the supermolecular structure of the polymer by means of X-ray diffraction. The degree of polymerisation was also analyzed using the GPC gel chromatography method and the viscometric method. In addition, nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy analysis was performed to explain the structural changes.
The obtained research results and their comprehensive analysis broaden the knowledge on cellulose decomposition and lignocellulosic systems under the influence of enzymes. The currently used enzymes derived from fungi and bacteria do not give the desired results, therefore the research on the search for new sources of biocatalysts undertaken in the project is important for the further development of many fields of science and technology. The research is part of the search for new cellulolytic complexes aimed at extending and explaining the state of knowledge regarding the process of lignocellulosic biomass degradation with the use of various enzymatic systems.
In addition, the project aimed to verify the hypotheses and to clarify whether the cellulase complexes obtained from different species and different developmental stages (larvae, imagoes) have different profiles of the composition and activity of enzymes. Do cellulolytic enzymes found in the alimentary tract of insects exhibit greater affinity to cellulose than enzymes collected from fungi? And also to what extent the enzymes collected from insects affect the structural changes of cellulose, including, inter alia, crystallinity, degree of polymerization, size of crystallites?
The obtained results allowed to select the most effective enzyme system for cellulose hydrolysis. The study used a complex of cellulolytic enzymes collected from four species of insects, including two producing endocellulases and two with a mixed system having endo- and exocellulases. The material for the research came from an insect breeding farm run at a constant temperature of 28oC and at a photoperiod of 12:12 h / h (day and night). Prior to the determination of enzyme activity in the extracts, the protein level was assayed using the bicinchoninic acid (BCA) colorimetric method, then the enzyme activity analysis was performed using the 3,5-dinitrosalicylic acid (DNSA) method and zymographic analysis.
Efficacy of isolated cellulolytic complexes was examined in the cellulose hydrolysis processes, which source were various materials: Whatman No. 1 filter paper strips, microcrystalline cellulose, carboxymethyl cellulose and cellulose in situ in the lignocellulose system.
The cellulose biodegradation products were determined by a standard colorimetric method, which allowed to determine the concentration of reducing sugars in terms of glucose, and by the high-performance liquid chromatography method with RI detection (HPLC / RI), which makes it possible to determine the concentration of end products of hydrolysis (mainly cellobiose and glucose).
On this basis, the activity of enzymes was determined (where 1 unit of enzyme activity took into account 1M reducing sugar released per minute, based on the amount of assayed protein in the enzyme extract) and it was verified which system was the most effective.
The study included a very detailed structural analysis of cellulose subjected to the bioconversion process, including the analysis of the degree of crystallinity by means of FTIR infrared spectroscopy, analysis of the supermolecular structure of the polymer by means of X-ray diffraction. The degree of polymerisation was also analyzed using the GPC gel chromatography method and the viscometric method. In addition, nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy analysis was performed to explain the structural changes.
The obtained research results and their comprehensive analysis broaden the knowledge on cellulose decomposition and lignocellulosic systems under the influence of enzymes. The currently used enzymes derived from fungi and bacteria do not give the desired results, therefore the research on the search for new sources of biocatalysts undertaken in the project is important for the further development of many fields of science and technology. The research is part of the search for new cellulolytic complexes aimed at extending and explaining the state of knowledge regarding the process of lignocellulosic biomass degradation with the use of various enzymatic systems.