Charakterystyka przemian białek nasion bobu podczas biokonwersji z zastosowaniem Rhizopus oligosporus, zwiększającej zawartość prekursora neuroprzekaźnika L-3,4-dihydroksyfenyloalaniny
Type
Project
Date Issued
2017
Discipline
food and nutrition technology
Abstract (PL)
1. Cel prowadzonych badań/hipoteza badawcza
Neuroprzekaźniki odgrywają kluczową rolę w przekazywaniu sygnałów między synapsami. Zaburzenia
wydzielania któregokolwiek z neuroprzekaźników może mieć poważne konsekwencje zdrowotne. W tym
projekcie, skupiłam się na prekursorze dopaminy - L-3,4-dihydroksyfenyloalaninie (L-DOPA), który jest
obecny w nasionach bobu. Dopamina jest głównym neuroprzekaźnikiem katecholowym w mózgu ssaków.
Bierze udział w regulacji różnych procesów, między innymi takich jak: utrzymanie postawy ciała
i poruszanie się, zapamiętywanie, uczenie się oraz interpretowanie bodźców emocjonalnych. Zaburzenia
związane zwytwarzaniem, wydzielaniem i działaniem dopaminy w mózgu powodują chorobę Parkinsona,
schizofrenię, depresję oraz skłonność do uzależnień. W przypadku choroby Parkinsona, w standardowej
terapii stosuje się leki zawierające L-DOPA oraz inhibitory obwodowej dekarboksylazy L-DOPA np.:
karbidopę czy benserazid. Niestety przyjmowanie tych leków niesie ze sobą wiele skutków ubocznych,
do których należą: zaburzenia gastryczne (nudności, wymioty i zaparcia), bóle głowy, wahania ciśnienia
tętniczego krwi, bezsenność lub nadmierna senność. Stąd też poszukiwanie naturalnych produktów,
pozwalających na poprawienie komfortu życia chorych stało się bardzo istotne. Jednym z naturalnych źródeł
zawierającym znaczne ilości L-DOPA okazał się bób. Przeprowadzono badania potwierdzające jego
skuteczność w niwelowaniu objawów choroby Parkinsona. Przypuszcza się, że bób zawiera związek/związki
zapobiegające występowaniu ww. skutków ubocznych. L-DOPA, w przeciwienstwie do dopaminy,
przekracza barierę krew-mózg, i następnie w mózgu, pod wpływem enzymów, jest przekształcana
do dopaminy. Badania wykazały, że istnieje możliwość zwiększenia ilości L-DOPA w bobie w trakcie
kiełkowania poprzez wywołanie stresu traktując nasiona hydrolizatem białka rybiego, laktoferyną
lub ekstraktem z oregano, a także przez biokonwersję w złożu stałym przy użyciu pleśni Rhizopus
oligosporus.
Celem moich badań jest poznanie procesu powstawania L-DOPA poprzez monitorowanie zmian profilu
białkowego nasion bobu podczas biokonwersji w złożu stałym z zastosowaniem pleśni R. oligosporus. Praca
będzie polegać monitorowaniu zmian w profilu białkowym, odnalezieniu frakcji których zmiany
skorelowane będą ze zmianami poziomu L-DOPA. Następnie wyizolowane zostaną frakcje białek z nasion
bobu, i poddane biokonwersji przy użyciu ww. pleśni. Identyfikacja białek oraz analiza wolnych
aminokwasów przed i po, a także kontrola na poszczególnych etapach biokonwersji pozwoli na bardziej
szczegółowe poznanie procesu syntezy L-DOPA w bobie. Hipoteza badawcza to istnienie białka lub grupy
białek w nasionach bobu ulegających biokonwersji do L-DOPA pod wpływem enzymów wytwarzanych
przez R. oligosporus.
2. Zastosowana metoda badawcza/metodyka
1. Skorelowanie zmniejszenia zawartości frakcji białek z wzrostem zawartości L-DOPA podczas
biokonwersji w złożu stałym zmielonych nasion bobu. W celu rozdziału białek zostanie wykorzystana
metoda SDS-PAGE oraz elektroforeza dwuwymiarowe IEF-SDS-PAGE. Natomiast do oznaczenia
L-DOPA zostanie wykorzystana metoda HPLC-DAD.
2. Izolacja wytypowanych białek przy pomocy chromatografi preparatywnej. Chromatogriafia prepratywna
zostanie przeprowadzona z wykorzystaniem żelu Sephadex. Kolumna o długości 50cm i średnicy 2,5cm
zostanie wypełniona złożem, którego wysokość będzie stanowiła około 20cm.
3. Biokonwersja wyizolowanych białek przy użyciu R. Oligosporus w złożu stałym. Biokonwersja zostanie
przeprowadzona z wykorzystaniem metody zaproponowanej przez Randhir i in. (2004) z modyfikacjami.
Zmielone ziarna bobu zostaną zmieszane z wyizolowanym białkiem, które wcześniej zostało
zliofilizowane oraz z wodą destylowaną w proporcji 1:2,5. Następnie mieszanina będzie sterylizowana,
zaszczepiona R. oligosporus i inkubowana w 30 oC.
4. Analiza aminokwasowa wyizolowanych białek z nasion bobu zostanie wykonana za pomocą
automatycznego sekwencjonera aminokwasów. Natomiast analiza proteomiczna z użyciem metody
HPLC/LC-MS. Otrzymane wyniki zostaną porównane z danymi obecnymi w bazie Mascot.
3. Wpływ spodziewanych rezultatów na rozwój nauki, cywilizacji, społeczeństwa
Wyniki badań pozwolą na poznanie w jaki sposób syntetyzowana jest L-DOPA w bobie w trakcie
biokonwersji w złożu stałym z wykorzystaniem R. oligosporus. Poznanie przemian zachodzących podczas
tego procesu pozwoli zrozumieć wpływ fermentacji typu tempe i szereg procesów, które nie zostały
dotychczas dostatecznie zbadane. Może też doprowadzić do zwiększenia możliwości sterowania procesem
fermentacji.
Wskazanie białka lub białek, które w największym stopniu ulegają konwersji do L-DOPA pod
wpływem enzymów wytwarzanych przez R. oligosporus, może w przyszłości stanowić podstawę
do prowadzenia nowych projektów, polegających na opracowaniu alternatywnego suplementu bądź produktu
zaliczanego do żywności funkcjonalnej, które mogłyby stanowić element codziennej diety osób cierpiących
na chorobę Parkinsona.
Neuroprzekaźniki odgrywają kluczową rolę w przekazywaniu sygnałów między synapsami. Zaburzenia
wydzielania któregokolwiek z neuroprzekaźników może mieć poważne konsekwencje zdrowotne. W tym
projekcie, skupiłam się na prekursorze dopaminy - L-3,4-dihydroksyfenyloalaninie (L-DOPA), który jest
obecny w nasionach bobu. Dopamina jest głównym neuroprzekaźnikiem katecholowym w mózgu ssaków.
Bierze udział w regulacji różnych procesów, między innymi takich jak: utrzymanie postawy ciała
i poruszanie się, zapamiętywanie, uczenie się oraz interpretowanie bodźców emocjonalnych. Zaburzenia
związane zwytwarzaniem, wydzielaniem i działaniem dopaminy w mózgu powodują chorobę Parkinsona,
schizofrenię, depresję oraz skłonność do uzależnień. W przypadku choroby Parkinsona, w standardowej
terapii stosuje się leki zawierające L-DOPA oraz inhibitory obwodowej dekarboksylazy L-DOPA np.:
karbidopę czy benserazid. Niestety przyjmowanie tych leków niesie ze sobą wiele skutków ubocznych,
do których należą: zaburzenia gastryczne (nudności, wymioty i zaparcia), bóle głowy, wahania ciśnienia
tętniczego krwi, bezsenność lub nadmierna senność. Stąd też poszukiwanie naturalnych produktów,
pozwalających na poprawienie komfortu życia chorych stało się bardzo istotne. Jednym z naturalnych źródeł
zawierającym znaczne ilości L-DOPA okazał się bób. Przeprowadzono badania potwierdzające jego
skuteczność w niwelowaniu objawów choroby Parkinsona. Przypuszcza się, że bób zawiera związek/związki
zapobiegające występowaniu ww. skutków ubocznych. L-DOPA, w przeciwienstwie do dopaminy,
przekracza barierę krew-mózg, i następnie w mózgu, pod wpływem enzymów, jest przekształcana
do dopaminy. Badania wykazały, że istnieje możliwość zwiększenia ilości L-DOPA w bobie w trakcie
kiełkowania poprzez wywołanie stresu traktując nasiona hydrolizatem białka rybiego, laktoferyną
lub ekstraktem z oregano, a także przez biokonwersję w złożu stałym przy użyciu pleśni Rhizopus
oligosporus.
Celem moich badań jest poznanie procesu powstawania L-DOPA poprzez monitorowanie zmian profilu
białkowego nasion bobu podczas biokonwersji w złożu stałym z zastosowaniem pleśni R. oligosporus. Praca
będzie polegać monitorowaniu zmian w profilu białkowym, odnalezieniu frakcji których zmiany
skorelowane będą ze zmianami poziomu L-DOPA. Następnie wyizolowane zostaną frakcje białek z nasion
bobu, i poddane biokonwersji przy użyciu ww. pleśni. Identyfikacja białek oraz analiza wolnych
aminokwasów przed i po, a także kontrola na poszczególnych etapach biokonwersji pozwoli na bardziej
szczegółowe poznanie procesu syntezy L-DOPA w bobie. Hipoteza badawcza to istnienie białka lub grupy
białek w nasionach bobu ulegających biokonwersji do L-DOPA pod wpływem enzymów wytwarzanych
przez R. oligosporus.
2. Zastosowana metoda badawcza/metodyka
1. Skorelowanie zmniejszenia zawartości frakcji białek z wzrostem zawartości L-DOPA podczas
biokonwersji w złożu stałym zmielonych nasion bobu. W celu rozdziału białek zostanie wykorzystana
metoda SDS-PAGE oraz elektroforeza dwuwymiarowe IEF-SDS-PAGE. Natomiast do oznaczenia
L-DOPA zostanie wykorzystana metoda HPLC-DAD.
2. Izolacja wytypowanych białek przy pomocy chromatografi preparatywnej. Chromatogriafia prepratywna
zostanie przeprowadzona z wykorzystaniem żelu Sephadex. Kolumna o długości 50cm i średnicy 2,5cm
zostanie wypełniona złożem, którego wysokość będzie stanowiła około 20cm.
3. Biokonwersja wyizolowanych białek przy użyciu R. Oligosporus w złożu stałym. Biokonwersja zostanie
przeprowadzona z wykorzystaniem metody zaproponowanej przez Randhir i in. (2004) z modyfikacjami.
Zmielone ziarna bobu zostaną zmieszane z wyizolowanym białkiem, które wcześniej zostało
zliofilizowane oraz z wodą destylowaną w proporcji 1:2,5. Następnie mieszanina będzie sterylizowana,
zaszczepiona R. oligosporus i inkubowana w 30 oC.
4. Analiza aminokwasowa wyizolowanych białek z nasion bobu zostanie wykonana za pomocą
automatycznego sekwencjonera aminokwasów. Natomiast analiza proteomiczna z użyciem metody
HPLC/LC-MS. Otrzymane wyniki zostaną porównane z danymi obecnymi w bazie Mascot.
3. Wpływ spodziewanych rezultatów na rozwój nauki, cywilizacji, społeczeństwa
Wyniki badań pozwolą na poznanie w jaki sposób syntetyzowana jest L-DOPA w bobie w trakcie
biokonwersji w złożu stałym z wykorzystaniem R. oligosporus. Poznanie przemian zachodzących podczas
tego procesu pozwoli zrozumieć wpływ fermentacji typu tempe i szereg procesów, które nie zostały
dotychczas dostatecznie zbadane. Może też doprowadzić do zwiększenia możliwości sterowania procesem
fermentacji.
Wskazanie białka lub białek, które w największym stopniu ulegają konwersji do L-DOPA pod
wpływem enzymów wytwarzanych przez R. oligosporus, może w przyszłości stanowić podstawę
do prowadzenia nowych projektów, polegających na opracowaniu alternatywnego suplementu bądź produktu
zaliczanego do żywności funkcjonalnej, które mogłyby stanowić element codziennej diety osób cierpiących
na chorobę Parkinsona.
Subject (pl)