Cząsteczki mikroRNA jako potencjalne biomarkery stanu zapalnego gruczołu mlekowego krów
Type
Project
Date Issued
2020
Author
Discipline
veterinary science
Abstract (PL)
Wprowadzenie: Określanie stopnia nasilenia stanu zapalnego w gruczole mlekowym krów oparte jest obecnie
na oznaczaniu liczby komórek somatycznych w 1 ml mleka. W metodzie tej stosuje się barwniki
fluoroscencyjne, które wiążą się z DNA komórek somatycznych a do zliczania znakowanych komórek
używane są aparaty wykorzystujące cytometrię przepływową. Metoda ta nie daje jednak zadowalających
wyników i od wielu lat poszukiwane są alternatywne rozwiązania pozwalające określać stopień nasilania stanu
zapalnego gruczołu mlekowego u krów [1]. Odkrycie nowej klasy cząsteczek, jakimi są krótkie, 22-24-
nukleotydowe mikroRNA (miRNA), zapoczątkowało nie tylko nowy rozdział w badaniach nad regulacją
ekspresji genów ale także dało możliwość ich wykorzystania w diagnostyce. Szczególnie cenne są tzw. krążące
miRNA w płynach fizjologicznych, których poziom ekspresji może ulegać zmianie pod wpływem czynników
patologicznych [2]. Do tej poro opisano ponad 20 cząsteczek miRNA obecnych w mleku krowim, których
ekspresja zmienia się na skutek stanu zapalanego wymienia [3,4]. Cząsteczki te mogą stanowić obiecujący
biomarker mastitis.
Hipoteza badawcza zakłada, że wzrost ekspresji wybranych cząsteczek miRNA krążących w mleku będzie
skorelowany ze stanem zapalnym wymienia krów i cząsteczki te będą mgły stanowić obiecujący biomarker
świadczący o jakości mleka krowiego.
Celem planowanych działań naukowych jest określenie poziomu ekspresji trzech wybranych cząsteczek
miRNA - miR21, miR146a i miR383 w 100 próbach mleka ćwiartkowego pochodzącego od krów z trzech
ferm zlokalizowanych na terenie województwa wielkopolskiego. Wielkość ferm to 120, 200 i 1200 krów w
laktacji. Sterylnie pobrane próbki mleka będą pochodzić z gruczołów zdrowych (n=50) jak i z mastitis (n=50).
Poziom liczby komórek somatycznych w 1 ml pobranego mleka będzie oznaczony za pomocą Delaval Cells
Counter. Zostanie także przeprowadzona izolacja bakterii przy użyciu podłoży agarowych namnażających
(Columbia Agar) i selektywnych (Sabouraud, PM test). Diagnostyka patogenów będzie ukierunkowana na
najpopularniejsze w Polsce środowiskowe patogeny mastitis, jak: Streptococcus uberis, Str. dysgalactiae, E.
coli, Klebsiella spp., Serratia spp., Proteus spp., Enterococcus sp., Prothoteca spp. [5]. W kolejnym etapie
badań zostanie oceniony poziom miRNA w mleku surowym. Próbki zostaną dostarczone do laboratorium w
ciągu kilku godzin od pobrania w warunkach chłodniczych. Izolacja cząsteczek miRNA oraz odwrotna
transkrypcja zostaną przeprowadzona przy użyciu komercyjnych zestawów. Poziom wybranych miRNA, tj.
miRNA miR21, miR146a, miR383 będzie odniesiony do cząsteczki referencyjnej miR92a. Do tego celu
zostanie zastosowana bardzo czuła metoda - cyfrowy emulsyjny PCR (ddPCR - droplet digital PCR). Należy
zaznaczyć, że sprzęt (QX200 Droplet Digital PCR System) do przeprowadzenia tych analiz jest na
wyposażeniu jednostki będącej miejscem zatrudnienia Wnioskodawcy oraz Wnioskodawca uzyska pełne
wsparcie merytoryczne i metodyczne w zakresie planowanych analiz od doświadczonych współpracowników
z jednostki.
Znaczenie badań: Zaplanowane doświadczenia pozwolą dokładniej poznać zależności między liczbą
komórek somatycznych w mleku a poziomem miRNA. Należy zaznaczyć, że badania te mają charakter
nowatorski i do tej pory nie były prowadzone na populacji bydła mlecznego w Polsce.
na oznaczaniu liczby komórek somatycznych w 1 ml mleka. W metodzie tej stosuje się barwniki
fluoroscencyjne, które wiążą się z DNA komórek somatycznych a do zliczania znakowanych komórek
używane są aparaty wykorzystujące cytometrię przepływową. Metoda ta nie daje jednak zadowalających
wyników i od wielu lat poszukiwane są alternatywne rozwiązania pozwalające określać stopień nasilania stanu
zapalnego gruczołu mlekowego u krów [1]. Odkrycie nowej klasy cząsteczek, jakimi są krótkie, 22-24-
nukleotydowe mikroRNA (miRNA), zapoczątkowało nie tylko nowy rozdział w badaniach nad regulacją
ekspresji genów ale także dało możliwość ich wykorzystania w diagnostyce. Szczególnie cenne są tzw. krążące
miRNA w płynach fizjologicznych, których poziom ekspresji może ulegać zmianie pod wpływem czynników
patologicznych [2]. Do tej poro opisano ponad 20 cząsteczek miRNA obecnych w mleku krowim, których
ekspresja zmienia się na skutek stanu zapalanego wymienia [3,4]. Cząsteczki te mogą stanowić obiecujący
biomarker mastitis.
Hipoteza badawcza zakłada, że wzrost ekspresji wybranych cząsteczek miRNA krążących w mleku będzie
skorelowany ze stanem zapalnym wymienia krów i cząsteczki te będą mgły stanowić obiecujący biomarker
świadczący o jakości mleka krowiego.
Celem planowanych działań naukowych jest określenie poziomu ekspresji trzech wybranych cząsteczek
miRNA - miR21, miR146a i miR383 w 100 próbach mleka ćwiartkowego pochodzącego od krów z trzech
ferm zlokalizowanych na terenie województwa wielkopolskiego. Wielkość ferm to 120, 200 i 1200 krów w
laktacji. Sterylnie pobrane próbki mleka będą pochodzić z gruczołów zdrowych (n=50) jak i z mastitis (n=50).
Poziom liczby komórek somatycznych w 1 ml pobranego mleka będzie oznaczony za pomocą Delaval Cells
Counter. Zostanie także przeprowadzona izolacja bakterii przy użyciu podłoży agarowych namnażających
(Columbia Agar) i selektywnych (Sabouraud, PM test). Diagnostyka patogenów będzie ukierunkowana na
najpopularniejsze w Polsce środowiskowe patogeny mastitis, jak: Streptococcus uberis, Str. dysgalactiae, E.
coli, Klebsiella spp., Serratia spp., Proteus spp., Enterococcus sp., Prothoteca spp. [5]. W kolejnym etapie
badań zostanie oceniony poziom miRNA w mleku surowym. Próbki zostaną dostarczone do laboratorium w
ciągu kilku godzin od pobrania w warunkach chłodniczych. Izolacja cząsteczek miRNA oraz odwrotna
transkrypcja zostaną przeprowadzona przy użyciu komercyjnych zestawów. Poziom wybranych miRNA, tj.
miRNA miR21, miR146a, miR383 będzie odniesiony do cząsteczki referencyjnej miR92a. Do tego celu
zostanie zastosowana bardzo czuła metoda - cyfrowy emulsyjny PCR (ddPCR - droplet digital PCR). Należy
zaznaczyć, że sprzęt (QX200 Droplet Digital PCR System) do przeprowadzenia tych analiz jest na
wyposażeniu jednostki będącej miejscem zatrudnienia Wnioskodawcy oraz Wnioskodawca uzyska pełne
wsparcie merytoryczne i metodyczne w zakresie planowanych analiz od doświadczonych współpracowników
z jednostki.
Znaczenie badań: Zaplanowane doświadczenia pozwolą dokładniej poznać zależności między liczbą
komórek somatycznych w mleku a poziomem miRNA. Należy zaznaczyć, że badania te mają charakter
nowatorski i do tej pory nie były prowadzone na populacji bydła mlecznego w Polsce.
Abstract (EN)
Introduction: Currently, the determination of the severity of inflammation in the mammary gland of cows is based
on the determination of the number of somatic cells in ml of milk. Dyes are used in this method
fluorescent, which bind to somatic cell DNA until labeled cell count
devices using flow cytometry are used. However, this method is not satisfactory
results and for many years alternative solutions to determine the severity of the condition have been sought
inflammatory mammary gland in cows [1]. Discovery of a new class of molecules, which are short, 22-24-
nucleotide microRNAs (miRNAs) not only initiated a new chapter in research on regulation
gene expression but also made it possible to use them in diagnostics. The so-called circulating
miRNAs in body fluids, the expression level of which may be altered by factors
pathological [2]. For this poro, more than 20 miRNA molecules present in cow's milk have been described
the expression changes due to the inflammation of the udder [3,4]. These molecules may prove to be promising
mastitis biomarker.
The research hypothesis assumes that an increase in the expression of selected miRNAs circulating in milk will be
correlated with inflammation of the udder of cows and these fog particles will be a promising biomarker
proving the quality of cow's milk.
The aim of the planned research activities is to determine the expression level of three selected molecules
miRNA - miR21, miR146a and miR383 in 100 samples of quarter milk from cows from three
farms located in the Greater Poland Voivodeship. The farm sizes are 120, 200 and 1,200 cows
lactation. Sterile milk samples will be obtained from healthy glands (n = 50) and mastitis (n = 50).
The somatic cell count in 1 ml of milk withdrawn will be determined with Delaval Cells
Counter. Bacterial isolation will also be performed using multiplication agar media
(Columbia Agar) and selective (Sabouraud, PM test). Pathogen diagnostics will focus on
the most popular environmental pathogens of mastitis in Poland, such as: Streptococcus uberis, Str. dysgalactiae, E.
coli, Klebsiella spp., Serratia spp., Proteus spp., Enterococcus sp., Prothoteca spp. [5]. In the next stage
The research will assess the level of miRNA in raw milk. The samples will be delivered to the laboratory in
within a few hours of collection under refrigerated conditions. Isolation of miRNA molecules and vice versa
transcription will be done using commercial kits. The level of selected miRNAs, i.e.
miRNA miR21, miR146a, miR383 will be referenced to the reference miR92a molecule. For this purpose
a very sensitive method will be used - digital emulsion PCR (ddPCR - droplet digital PCR). Belongs
point out that the hardware (QX200 Droplet Digital PCR System) to perform these analyzes is on
equipping the unit which is the place of employment of the Applicant and the Applicant will receive a full
substantive and methodological support in the scope of planned analyzes from experienced associates
from the unit.
The importance of the research: The planned experiments will allow us to better understand the relationships between the numbers
somatic cells in milk and the level of miRNAs. It should be noted that these studies are of a nature
innovative and so far have not been conducted on the population of dairy cattle in Poland.
on the determination of the number of somatic cells in ml of milk. Dyes are used in this method
fluorescent, which bind to somatic cell DNA until labeled cell count
devices using flow cytometry are used. However, this method is not satisfactory
results and for many years alternative solutions to determine the severity of the condition have been sought
inflammatory mammary gland in cows [1]. Discovery of a new class of molecules, which are short, 22-24-
nucleotide microRNAs (miRNAs) not only initiated a new chapter in research on regulation
gene expression but also made it possible to use them in diagnostics. The so-called circulating
miRNAs in body fluids, the expression level of which may be altered by factors
pathological [2]. For this poro, more than 20 miRNA molecules present in cow's milk have been described
the expression changes due to the inflammation of the udder [3,4]. These molecules may prove to be promising
mastitis biomarker.
The research hypothesis assumes that an increase in the expression of selected miRNAs circulating in milk will be
correlated with inflammation of the udder of cows and these fog particles will be a promising biomarker
proving the quality of cow's milk.
The aim of the planned research activities is to determine the expression level of three selected molecules
miRNA - miR21, miR146a and miR383 in 100 samples of quarter milk from cows from three
farms located in the Greater Poland Voivodeship. The farm sizes are 120, 200 and 1,200 cows
lactation. Sterile milk samples will be obtained from healthy glands (n = 50) and mastitis (n = 50).
The somatic cell count in 1 ml of milk withdrawn will be determined with Delaval Cells
Counter. Bacterial isolation will also be performed using multiplication agar media
(Columbia Agar) and selective (Sabouraud, PM test). Pathogen diagnostics will focus on
the most popular environmental pathogens of mastitis in Poland, such as: Streptococcus uberis, Str. dysgalactiae, E.
coli, Klebsiella spp., Serratia spp., Proteus spp., Enterococcus sp., Prothoteca spp. [5]. In the next stage
The research will assess the level of miRNA in raw milk. The samples will be delivered to the laboratory in
within a few hours of collection under refrigerated conditions. Isolation of miRNA molecules and vice versa
transcription will be done using commercial kits. The level of selected miRNAs, i.e.
miRNA miR21, miR146a, miR383 will be referenced to the reference miR92a molecule. For this purpose
a very sensitive method will be used - digital emulsion PCR (ddPCR - droplet digital PCR). Belongs
point out that the hardware (QX200 Droplet Digital PCR System) to perform these analyzes is on
equipping the unit which is the place of employment of the Applicant and the Applicant will receive a full
substantive and methodological support in the scope of planned analyzes from experienced associates
from the unit.
The importance of the research: The planned experiments will allow us to better understand the relationships between the numbers
somatic cells in milk and the level of miRNAs. It should be noted that these studies are of a nature
innovative and so far have not been conducted on the population of dairy cattle in Poland.