Model ex vivo układu podwzgórze-przysadka – alternatywa dla badań in vivo nazwierzętach. Udział feniksyny w modulacji aktywności osi gonadotropowej u owiec
Type
Project
Date Issued
2022
Discipline
animal science and fisheries
Abstract (PL)
Prezentowany projekt ma charakter dwukierunkowy. Po pierwsze zastosowanie zupełnie nowej, bardzo dynamicznie rozwijającej się technologii narządy na chipie do odtworzenia układu podwzgórzowo-przysadkowego w warunkach ex vivo, po drugie – charakterystyka funkcjonalna działania PNX w obszarze podwzgórza w celu weryfikacji przydatności zaprojektowanego ex system vivo do badań mechanizmów neuroendokrynnych. Proponowany model „mózgowych slajdów na chipie” może być innowacyjną technologią, która zastąpi eksperymenty na zwierzętach in vivo, jak również replikację układu podwzgórzowo-przysadkowego, a technika ta doskonale dopasowuje się do filozofii 3R (redukcja, zastępowanie, udoskonalanie).
Feniksyna (PNX) została zidentyfikowany w 2013 r. za pomocą narzędzi bioinformatycznych i występuje w dwóch aktywnych formach molekularnych PNX-14 i PNX-20. Obie formy są wysoce konserwatywne u wszystkich gatunków kręgowców, wykazują te same aktywności biologiczne. Ekspresję receptora PNX i PNX (GPR173) stwierdzono w kilku obszarach podwzgórza regulujących homeostazę energetyczną organizmu oraz w przysadce i jajniku. Ta lokalizacja sugeruje, że PNX może brać udział w interakcji między ośrodkiem apetytu a funkcjonowaniem osi gonadotropowej.
Celem projektu jest porównanie wyników uzyskanych w modelach ex vivo i in vivo na przykładzie działania PNX na modulację aktywności osi gonadotropowej u owiec. Hipoteza badawcza zakłada, że: 1) układ podwzgórzowo-przysadkowy ex vivo może naśladować eksperyment na zwierzętach in vivo i być wykorzystany w badaniach neuroendokrynologicznych
Feniksyna (PNX) została zidentyfikowany w 2013 r. za pomocą narzędzi bioinformatycznych i występuje w dwóch aktywnych formach molekularnych PNX-14 i PNX-20. Obie formy są wysoce konserwatywne u wszystkich gatunków kręgowców, wykazują te same aktywności biologiczne. Ekspresję receptora PNX i PNX (GPR173) stwierdzono w kilku obszarach podwzgórza regulujących homeostazę energetyczną organizmu oraz w przysadce i jajniku. Ta lokalizacja sugeruje, że PNX może brać udział w interakcji między ośrodkiem apetytu a funkcjonowaniem osi gonadotropowej.
Celem projektu jest porównanie wyników uzyskanych w modelach ex vivo i in vivo na przykładzie działania PNX na modulację aktywności osi gonadotropowej u owiec. Hipoteza badawcza zakłada, że: 1) układ podwzgórzowo-przysadkowy ex vivo może naśladować eksperyment na zwierzętach in vivo i być wykorzystany w badaniach neuroendokrynologicznych
2) PNX moduluje aktywność osi gonadotropowej na poziomie podwzgórzowo-przysadkowym.
W celu weryfikacji postawionych hipotez zostaną przeprowadzone trzy eksperymenty na dojrzałych płciowo polskich owcach Merynosów w fazie lutealnej cyklu rujowego (8–10 dni). U owiec przeznaczonych do eksperymentu II i III kaniule prowadzące ze stali nierdzewnej zostaną wszczepione pod kontrolą stereotaktyczną do trzeciej komory mózgu (IIIv). Celem eksperymentu I (n=16) będzie opracowanie alternatywnego układu podwzgórzowo-przysadkowego ex vivo, który będzie imitował konwencjonalny model owiec in vivo. Celem doświadczenia II (n=20) będzie zbadanie stężenia endogennych PNX i GnRH w płynie mózgowo-rdzeniowym w zależności od stanu energetycznego owcy oraz ustalenie optymalnej dawki PNX wykazującej wpływ na aktywność gonadotropin. Celem eksperymentu III (n=32) będzie zbadanie wpływu egzogennej PNX na zmiany aktywności wydzielniczej osi gonadotropowej oraz określenie interakcji PNX z aktywnością neuronalną NPY/AgRP i CART/α- Neurony MSH i aktywność neuronów KNDy. Podczas eksperymentów zostaną wykonane pobranie płynu mózgowo-rdzeniowego z IIIv podwzgórza (doświadczenie II), serie wlewów do IIIv (kontrola – roztwór Ringera-Locke'a i eksperymentalne – PNX) oraz pobranie krwi w celu oznaczenia stężenia gonadotropiny. Po ostatniej infuzji owce zostaną poddane eutanazji w celu uzyskania wybranych struktur podwzgórza (POA, AHA, ARC, LHA, ME) oraz przysadki mózgowej. Podwzgórze i przysadka zostaną zebrane i wykorzystane do analiz biologii molekularnej, testów immunohistochemicznych.
Planowane eksperymenty:
1. Oznaczanie ekspresji mRNA: GnRH, NPY, AgRP, CART, POMC, PAM, KNDy, GPR173, LH, FSH, GnRH-R, ObR, IR – doświadczenia I, II, III
W celu weryfikacji postawionych hipotez zostaną przeprowadzone trzy eksperymenty na dojrzałych płciowo polskich owcach Merynosów w fazie lutealnej cyklu rujowego (8–10 dni). U owiec przeznaczonych do eksperymentu II i III kaniule prowadzące ze stali nierdzewnej zostaną wszczepione pod kontrolą stereotaktyczną do trzeciej komory mózgu (IIIv). Celem eksperymentu I (n=16) będzie opracowanie alternatywnego układu podwzgórzowo-przysadkowego ex vivo, który będzie imitował konwencjonalny model owiec in vivo. Celem doświadczenia II (n=20) będzie zbadanie stężenia endogennych PNX i GnRH w płynie mózgowo-rdzeniowym w zależności od stanu energetycznego owcy oraz ustalenie optymalnej dawki PNX wykazującej wpływ na aktywność gonadotropin. Celem eksperymentu III (n=32) będzie zbadanie wpływu egzogennej PNX na zmiany aktywności wydzielniczej osi gonadotropowej oraz określenie interakcji PNX z aktywnością neuronalną NPY/AgRP i CART/α- Neurony MSH i aktywność neuronów KNDy. Podczas eksperymentów zostaną wykonane pobranie płynu mózgowo-rdzeniowego z IIIv podwzgórza (doświadczenie II), serie wlewów do IIIv (kontrola – roztwór Ringera-Locke'a i eksperymentalne – PNX) oraz pobranie krwi w celu oznaczenia stężenia gonadotropiny. Po ostatniej infuzji owce zostaną poddane eutanazji w celu uzyskania wybranych struktur podwzgórza (POA, AHA, ARC, LHA, ME) oraz przysadki mózgowej. Podwzgórze i przysadka zostaną zebrane i wykorzystane do analiz biologii molekularnej, testów immunohistochemicznych.
Planowane eksperymenty:
1. Oznaczanie ekspresji mRNA: GnRH, NPY, AgRP, CART, POMC, PAM, KNDy, GPR173, LH, FSH, GnRH-R, ObR, IR – doświadczenia I, II, III
2. Oznaczanie lokalizacji i stężenia immunoreaktywnych GnRH, NPY, AgRP, CART, POMC, Kiss, Dyn, NKB, LH, FSH – doświadczenie I, III
3. Oznaczanie ekspresji PNX, IR, ObR, GnRH-R, Kiss w tkance podwzgórza i krwi – doświadczenie II, III
4. Oznaczanie stężeń endogennych PNX i GnRH w płynie mózgowo-rdzeniowym (ELISA) – eksperyment II
5. Oznaczanie stężeń PNX, LH i FSH w pożywce i osoczu, pomiar parametrów pulsacyjnego uwalniania, analiza biochemiczna krwi – doświadczenia II, III.
W obu układach eksperymentalnych, w modelach ex vivo i in vivo, będą monitorowane badania zmian zachodzących w kluczowych układach regulacyjnych: osi gonadotropowej, ośrodku regulacji apetytu oraz układzie generatora impulsów GnRH.
Proponowane podejście pozwoli na monitorowanie zmian wybranych neuronów, po precyzyjnym podaniu PNX, blisko struktur podwzgórza, w których aktywny jest badany neuropeptyd. Uzyskane wyniki dostarczą również nowych, unikalnych danych na temat wpływu neuropeptydów na reprodukcję i pozwolą lepiej zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw takich zaburzeń jak anoreksja, bulimia i zaburzenia płodności.
W obu układach eksperymentalnych, w modelach ex vivo i in vivo, będą monitorowane badania zmian zachodzących w kluczowych układach regulacyjnych: osi gonadotropowej, ośrodku regulacji apetytu oraz układzie generatora impulsów GnRH.
Proponowane podejście pozwoli na monitorowanie zmian wybranych neuronów, po precyzyjnym podaniu PNX, blisko struktur podwzgórza, w których aktywny jest badany neuropeptyd. Uzyskane wyniki dostarczą również nowych, unikalnych danych na temat wpływu neuropeptydów na reprodukcję i pozwolą lepiej zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw takich zaburzeń jak anoreksja, bulimia i zaburzenia płodności.
Abstract (EN)
The presented project has a two-way direction. First, application of a completely new, very dynamically developing technology organs-on-a-chip to recreate the hypothalamic-pituitary system in ex vivo conditions and second – functional characterization of PNX action in the hypothalamus area to verify the suitability of the designed ex vivo system for research on neuroendocrine mechanisms. The proposed ‘brain slides-on-a-chip’ model may be an innovative technology to replace in vivo animal experiments as well as replicating the hypothalamic-pituitary system and this technic adaptsperfectly to the 3R philosophy (reduction, replacement, refinement).
Phoenixin (PNX) was identified in 2013 via a bioinformatic approach and it exists in two active molecular forms PNX-14 and PNX-20. Both forms are highly conserved throughout vertebrate species, exhibit the same biological activities. The expression of PNX and PNX receptor (GPR173) was found in several hypothalamic areas governing energetic homeostasis of the organism as well as in the pituitary and ovary. This location suggest that PNX may participate in cross-talk between appetite center and gonadotrophic axis functioning.
The aim of the project is to compare the results obtained in ex vivo and in vivo models on the example of the PNX action on the modulation of gonadotrophic axis activity in sheep. Research hypothesis assumes that: 1) ex vivo hypothalamicpituitary system can mimic the in vivo animal experiment and be used in neuroendocrinological studies
Phoenixin (PNX) was identified in 2013 via a bioinformatic approach and it exists in two active molecular forms PNX-14 and PNX-20. Both forms are highly conserved throughout vertebrate species, exhibit the same biological activities. The expression of PNX and PNX receptor (GPR173) was found in several hypothalamic areas governing energetic homeostasis of the organism as well as in the pituitary and ovary. This location suggest that PNX may participate in cross-talk between appetite center and gonadotrophic axis functioning.
The aim of the project is to compare the results obtained in ex vivo and in vivo models on the example of the PNX action on the modulation of gonadotrophic axis activity in sheep. Research hypothesis assumes that: 1) ex vivo hypothalamicpituitary system can mimic the in vivo animal experiment and be used in neuroendocrinological studies
2) PNX modulates the gonadotrophic axis activity at the hypothalamic-pituitary level.
In order to verify the hypotheses, three experiments on sexually mature Merino Polish sheep in the luteal phase of the estrous cycle (8–10 day) will be performed. In sheep intended for experiment II and III, stainless steel guide cannulas will be implanted under stereotaxic control into the third ventricle of the brain (IIIv). The aim of experiment I (n=16) will be to development of an alternative hypothalamic-pituitary ex vivo system which will imitating the conventional in vivo sheep model. The aim of experiment II (n=20) will be to investigate the concentration of endogenic PNX and GnRH in CSF depending on the energy status of the sheep and set the optimum dose of PNX demonstrating the influence on the gonadotrophins activity. The aims of experiment III (n=32) will be to investigate the influence of exogenous PNX on the changes in the secretory activity of the gonadotrophic axis, and to determine the interaction of PNX with neuronal activity of NPY/AgRP and CART/α- MSH neurons and the activity of KNDy neurons. During experiments the collections of CSF from IIIv of hypothalamus (experiment II), infusions series into the IIIv (control – Ringer-Locke solution and experimentals – PNX) and collections of blood to determine the concentration of gonadotrophin will be performed. After the last infusion, sheep will be euthanized in order to obtain the selected hypothalamic structures (POA, AHA, ARC, LHA, ME) and pituitary gland. Hypothalamus and pituitary will be collected and used for molecular biology analyses, immunohistochemical assays.
Planned achievements:
1. Determination of mRNA expression of: GnRH, NPY, AgRP, CART, POMC, PAM, KNDy, GPR173, LH, FSH, GnRH-R, ObR, IR – experiments I, II, III
In order to verify the hypotheses, three experiments on sexually mature Merino Polish sheep in the luteal phase of the estrous cycle (8–10 day) will be performed. In sheep intended for experiment II and III, stainless steel guide cannulas will be implanted under stereotaxic control into the third ventricle of the brain (IIIv). The aim of experiment I (n=16) will be to development of an alternative hypothalamic-pituitary ex vivo system which will imitating the conventional in vivo sheep model. The aim of experiment II (n=20) will be to investigate the concentration of endogenic PNX and GnRH in CSF depending on the energy status of the sheep and set the optimum dose of PNX demonstrating the influence on the gonadotrophins activity. The aims of experiment III (n=32) will be to investigate the influence of exogenous PNX on the changes in the secretory activity of the gonadotrophic axis, and to determine the interaction of PNX with neuronal activity of NPY/AgRP and CART/α- MSH neurons and the activity of KNDy neurons. During experiments the collections of CSF from IIIv of hypothalamus (experiment II), infusions series into the IIIv (control – Ringer-Locke solution and experimentals – PNX) and collections of blood to determine the concentration of gonadotrophin will be performed. After the last infusion, sheep will be euthanized in order to obtain the selected hypothalamic structures (POA, AHA, ARC, LHA, ME) and pituitary gland. Hypothalamus and pituitary will be collected and used for molecular biology analyses, immunohistochemical assays.
Planned achievements:
1. Determination of mRNA expression of: GnRH, NPY, AgRP, CART, POMC, PAM, KNDy, GPR173, LH, FSH, GnRH-R, ObR, IR – experiments I, II, III
2. Determination of localization and concentration of immunoreactive GnRH, NPY, AgRP, CART, POMC, Kiss, Dyn, NKB, LH, FSH – experiment I, III
3. Determinations of PNX, IR, ObR, GnRH-R, Kiss expression in hypothalami tissue and blood – experiment II, III
4. Determination of endogenous PNX and GnRH concentrations in the CSF (ELISA) – experiment II
5. Determination of PNX, LH and FSH concentrations in medium and plasma, measurement of pulsatile release parameters, biochemical analysis of blood – experiments II, III.
In both experimental systems, in ex vivo and in vivo models the examination of changes occurring in key regulatory systems: the gonadotrophic axis, appetite regulating center and the GnRH pulse generator system will be monitored.
Proposed approached will allow to monitor changes of selected neurons, after the precise PNX administration, closely to the hypothalamus structures where the examined neuropeptide is active. Obtained results will provide also new unique data on the effects of neuropeptides on the reproduction and allow to better understanding of the mechanisms underlying such disorders as anorexia, bulimia and fertility disturbances.
In both experimental systems, in ex vivo and in vivo models the examination of changes occurring in key regulatory systems: the gonadotrophic axis, appetite regulating center and the GnRH pulse generator system will be monitored.
Proposed approached will allow to monitor changes of selected neurons, after the precise PNX administration, closely to the hypothalamus structures where the examined neuropeptide is active. Obtained results will provide also new unique data on the effects of neuropeptides on the reproduction and allow to better understanding of the mechanisms underlying such disorders as anorexia, bulimia and fertility disturbances.