Wybrane aspekty metabolizmu lipidów w oocytach kota domowego
Type
Project
Date Issued
2020
Author
Discipline
veterinary science
Abstract (PL)
Kot domowy jest zarówno popularnym zwierzęciem towarzyszącym jak i doskonałym modelem zwierzęcym dla zagrożonych wyginięciem dzikich kotowatych oraz wielu chorób człowieka (np. cukrzyca, mukopolisacharydoza, porfiria). Pomimo intensywnych badań prowadzonych od lat ’80 XX wieku, efektywność kompleksowej procedury pozyskiwania zarodków kota in vitro (IVM/IVF/IVC) jest niższa niż np. u bydła (% blastocyst kot 20-30%, bydło 30-40%). Nie opracowano także skutecznej i powtarzalnej procedury mrożenia zarodków kotowatych. Oocyty kota charakteryzuje bardzo ciemna i homogenna ooplazma. Pomimo ogólnie panującego przekonania, że ciemna ooplazma wynika z wysokiej zawartości lipidów, wiedza na ten temat dla kota jest fragmentaryczna, a jedyna publikacja pochodzi z 1965 roku. Guraya [1] wykazał wysoką zawartość lipidów uwidacznianych metodami histochemicznymi z zastosowaniem barwnika Sudan (Sudan dye). Należy podkreślić, że liczba kropli lipidowych (lipid droplets, LD) w oocytach ssaków jest gatunkowo specyficzna (np. świnia 580±164, bydło 665±288) i podlega dynamicznym zmianom podczas wzrostu i dojrzewania [2, 3]. Wiadomo, że efektywność mrożenia oocytów ssaków wiąże się bezpośrednio z ilością lipidów w ooplazmie [4]. Za główną przyczynę niskiej przeżywalności mrożonych oocytów kota uznaje się wysoką zawartość lipidów, które ograniczają przenikanie substancji krioochronnych do wnętrza komórek. Negatywny wpływ lipidów został ograniczony poprzez wirowanie oocytów przed witryfikacją i uzyskanie efektu polaryzacji tzn. zgromadzenia lipidów na biegunie komórki [4]. Wykazano, że polaryzacja lipidów polepsza przeżywalność oocytów kota po ogrzaniu.
Komórki pęcherzykowe, głównie wzgórka jajonośnego (cumulus cells, CC) są kluczowe dla wzrostu, dojrzewania i zapłodnienia oocytu [1]. W aspekcie metabolizmu lipidów, CC pośredniczą w interakcji oocyt-środowisko pęcherzyka pełniąc m.in. funkcje ochronne w stosunku do oocytu poprzez np. gromadzenie nadmiaru kwasów tłuszczowych (lipotoksyczność) [5]. Wykazaliśmy, że dojrzewanie kompleksów oocyt-cumulus (cumulus–oocyte complex, COC) świni domowej w pożywce z dodatkiem kwasów tłuszczowych modyfikuje metabolizm lipidów szczególnie w CC [2]. W przypadku kota domowego wiele aspektów interakcji oocyt – CC, w tym metabolizm lipidów, pozostaje do wyjaśnienia.
Niniejszy projekt dotyczy wybranych aspektów metabolizmu lipidów w COC kota domowego. Celem badań jest charakterystyka kropli lipidowych oraz analiza ekspresji mRNA wybranych genów regulujących metabolizm lipidów w oocytach oraz CC. COC będą pozyskiwane z jajników kotek poddawanych rutynowym zbiegom owariohisterektomii (sterylizacji) w komercyjnych gabinetach weterynaryjnych. Badaniami objęte będą oocyty i CC zarówno przed jak i po dojrzewaniu in vitro (IVM) w standardowych warunkach [6]. Projekt obejmuje 2 wątki badawcze: analizę LD oraz ekspresji mRNA 8 genów kontrolujących metabolizm lipidów. Krople lipidowe oraz chromatyna będą barwione fluorescencyjnie (LD - BODIPY 493/50, chromatyna - DAPI) zgodnie z procedurą stosowaną w naszym laboratorium [2]. Ocena preparatów pod mikroskopem konfokalnym pozwoli na charakterystykę LD oraz ocenę stadium mejozy oocytu. Analiza zakłada sekcje optyczne odpowiednio co 10 µm (oocyty) i co 0.3 µm (CC). Parametry LD (rozmiar, liczba, % powierzchni oocytu zajmowanej przez LD) będą analizowane przy użyciu programu ImageJ-Fiji. Analiza transkryptów 8 genów (ACACA, FABP4, FASN, PNPLA2, CD36, PLIN2, SREBF1, PPARG) będzie prowadzona w oocytach i CC przed i po IVM techniką RT-qPCR stosowaną w naszym laboratorium [2].
Podsumowując, metabolizm lipidów cieszy się obecnie szczególnym zainteresowaniem badaczy ze względu na jego związek z jakością oocytów i zarodków nie tylko w kontekście mrożenia. Dlatego zagadnienie to ma kluczowe znaczenie dla optymalizacji procedur IVM/IVF/IVC oraz kriokonserwacji (witryfikacji) oocytów kota domowego. Charakterystyka wybranych aspektów metabolizmu lipidów COC kota stanowi doskonałe preludium badań zmierzających do kompleksowej analizy związku lipidów z efektywnością witryfikacji oocytów tego gatunku. Ponadto, niniejszy projekt stanowi poszerzenie dotychczasowych badań autorki z zakresu biotechnik rozrodu zwierząt kotowatych (IVF, witryfikacja) [6,7,8]. Wyniki niniejszego projektu poszerzą także wiedzę na temat biogenezy lipidów w oocytach kota oraz interakcji oocyt-CC.
[1] Guraya J Experimental Zool 1965
Komórki pęcherzykowe, głównie wzgórka jajonośnego (cumulus cells, CC) są kluczowe dla wzrostu, dojrzewania i zapłodnienia oocytu [1]. W aspekcie metabolizmu lipidów, CC pośredniczą w interakcji oocyt-środowisko pęcherzyka pełniąc m.in. funkcje ochronne w stosunku do oocytu poprzez np. gromadzenie nadmiaru kwasów tłuszczowych (lipotoksyczność) [5]. Wykazaliśmy, że dojrzewanie kompleksów oocyt-cumulus (cumulus–oocyte complex, COC) świni domowej w pożywce z dodatkiem kwasów tłuszczowych modyfikuje metabolizm lipidów szczególnie w CC [2]. W przypadku kota domowego wiele aspektów interakcji oocyt – CC, w tym metabolizm lipidów, pozostaje do wyjaśnienia.
Niniejszy projekt dotyczy wybranych aspektów metabolizmu lipidów w COC kota domowego. Celem badań jest charakterystyka kropli lipidowych oraz analiza ekspresji mRNA wybranych genów regulujących metabolizm lipidów w oocytach oraz CC. COC będą pozyskiwane z jajników kotek poddawanych rutynowym zbiegom owariohisterektomii (sterylizacji) w komercyjnych gabinetach weterynaryjnych. Badaniami objęte będą oocyty i CC zarówno przed jak i po dojrzewaniu in vitro (IVM) w standardowych warunkach [6]. Projekt obejmuje 2 wątki badawcze: analizę LD oraz ekspresji mRNA 8 genów kontrolujących metabolizm lipidów. Krople lipidowe oraz chromatyna będą barwione fluorescencyjnie (LD - BODIPY 493/50, chromatyna - DAPI) zgodnie z procedurą stosowaną w naszym laboratorium [2]. Ocena preparatów pod mikroskopem konfokalnym pozwoli na charakterystykę LD oraz ocenę stadium mejozy oocytu. Analiza zakłada sekcje optyczne odpowiednio co 10 µm (oocyty) i co 0.3 µm (CC). Parametry LD (rozmiar, liczba, % powierzchni oocytu zajmowanej przez LD) będą analizowane przy użyciu programu ImageJ-Fiji. Analiza transkryptów 8 genów (ACACA, FABP4, FASN, PNPLA2, CD36, PLIN2, SREBF1, PPARG) będzie prowadzona w oocytach i CC przed i po IVM techniką RT-qPCR stosowaną w naszym laboratorium [2].
Podsumowując, metabolizm lipidów cieszy się obecnie szczególnym zainteresowaniem badaczy ze względu na jego związek z jakością oocytów i zarodków nie tylko w kontekście mrożenia. Dlatego zagadnienie to ma kluczowe znaczenie dla optymalizacji procedur IVM/IVF/IVC oraz kriokonserwacji (witryfikacji) oocytów kota domowego. Charakterystyka wybranych aspektów metabolizmu lipidów COC kota stanowi doskonałe preludium badań zmierzających do kompleksowej analizy związku lipidów z efektywnością witryfikacji oocytów tego gatunku. Ponadto, niniejszy projekt stanowi poszerzenie dotychczasowych badań autorki z zakresu biotechnik rozrodu zwierząt kotowatych (IVF, witryfikacja) [6,7,8]. Wyniki niniejszego projektu poszerzą także wiedzę na temat biogenezy lipidów w oocytach kota oraz interakcji oocyt-CC.
[1] Guraya J Experimental Zool 1965
160:123-35. [2] Pawlak P. et al. Biol Reprod 2020
103: 36-48. [3] Warzych et al. Theriogenology 2017
87: 36-47. [4] Galiguis at al. Cryobiology 2014
68: 459-66. [5] Warzych E. J Reprod Dev 2020
66: 1-7. [6] Mikołajewska N. et al. Reprod Domest Anim 2012
47 Suppl 6:295–9. [7] Sowińska N. et al. Reprod Domest Anim 2016
51:1–6 [8] Sowińska N. et al. Reprod Domest Anim 2017
00:1–8.
Abstract (EN)
The domestic cat is both a popular companion animal and an excellent animal model for endangered wild felids and many human diseases (e.g. diabetes, mucopolysaccharidosis, porphyria). Despite intensive research conducted since the 1980s, the effectiveness of the comprehensive in vitro cat embryo collection procedure (IVM / IVF / IVC) is lower than, for example, in cattle (% cat blastocysts 20-30%, cattle 30-40%). An efficient and reproducible procedure for freezing feline embryos has not been developed either. Cat's oocytes are characterized by a very dark and homogeneous ooplasm. Despite the general belief that dark ooplasma is due to high lipid content, knowledge on the subject for cats is fragmentary, with the only publication dating back to 1965. Guraya [1] showed a high content of lipids visualized by histochemical methods with the use of Sudan dye. It should be emphasized that the number of lipid droplets (LD) in mammalian oocytes is species-specific (eg. pig 580 ± 164, cattle 665 ± 288) and is subject to dynamic changes during growth and maturation [2, 3]. It is known that the effectiveness of freezing mammalian oocytes is directly related to the amount of lipids in the ooplasm [4]. The high content of lipids, which limit the penetration of cryoprotective substances into the cells, is considered the main reason for the low survival of cat's frozen oocytes. The negative effect of lipids was limited by centrifuging oocytes before vitrification and obtaining the polarization effect, ie. the accumulation of lipids at the cell pole [4]. Lipid polarization has been shown to improve survival of cat oocytes when heated.
Follicular cells, mainly cumulus cells (CC), are crucial for the growth, maturation and fertilization of the oocyte [1]. In terms of lipid metabolism, CC mediates the interaction of the oocyte-vesicle environment, acting i.a. protective functions in relation to the oocyte through, for example, the accumulation of excess fatty acids (lipotoxicity) [5]. We have shown that the maturation of oocyte-cumulus complexes (COC) in domestic pig in a medium with the addition of fatty acids modifies lipid metabolism, especially in CC [2]. For the domestic cat, many aspects of the oocyte-CC interaction, including lipid metabolism, remain to be clarified.
This project deals with some aspects of lipid metabolism in the COC of the domestic cat. The aim of the research is the characterization of lipid drops and the analysis of mRNA expression of selected genes regulating lipid metabolism in oocytes and CC. COCs will be obtained from the ovaries of female cats that undergo routine ovariohysterectomy procedures in commercial veterinary practices. The research will cover oocytes and CC both before and after in vitro maturation (IVM) under standard conditions [6]. The project covers 2 research threads: the analysis of LD and mRNA expression of 8 genes controlling lipid metabolism. Lipid drops and chromatin will be fluorescently stained (LD - BODIPY 493/50, chromatin - DAPI) according to the procedure used in our laboratory [2]. The evaluation of the slides under a confocal microscope will enable the characterization of LD and the assessment of the stage of oocyte meiosis. The analysis assumes optical sections every 10 µm (oocytes) and every 0.3 µm (CC), respectively. The LD parameters (size, number,% of the oocyte area occupied by LD) will be analyzed using ImageJ-Fiji. Transcript analysis of 8 genes (ACACA, FABP4, FASN, PNPLA2, CD36, PLIN2, SREBF1, PPARG) will be performed in oocytes and CC before and after IVM using the RT-qPCR technique used in our laboratory [2].
In summary, lipid metabolism is currently of particular interest to researchers due to its relationship with the quality of oocytes and embryos, not only in the context of freezing. Therefore, this issue is of key importance for the optimization of IVM / IVF / IVC procedures and the cryopreservation (vitrification) of domestic cat oocytes. The characterization of selected aspects of cat COC lipid metabolism is an excellent prelude to research aimed at a comprehensive analysis of the relationship between lipids and the efficiency of oocyte vitrification of this species. In addition, this project is an extension of the author's research to date in the field of biotechnology of reproduction of felids (IVF, vitrification) [6,7,8]. The results of this project will also improve understanding of lipid biogenesis in cat oocytes and oocyte-CC interactions.
[1] Guraya J Experimental Zool 1965
Follicular cells, mainly cumulus cells (CC), are crucial for the growth, maturation and fertilization of the oocyte [1]. In terms of lipid metabolism, CC mediates the interaction of the oocyte-vesicle environment, acting i.a. protective functions in relation to the oocyte through, for example, the accumulation of excess fatty acids (lipotoxicity) [5]. We have shown that the maturation of oocyte-cumulus complexes (COC) in domestic pig in a medium with the addition of fatty acids modifies lipid metabolism, especially in CC [2]. For the domestic cat, many aspects of the oocyte-CC interaction, including lipid metabolism, remain to be clarified.
This project deals with some aspects of lipid metabolism in the COC of the domestic cat. The aim of the research is the characterization of lipid drops and the analysis of mRNA expression of selected genes regulating lipid metabolism in oocytes and CC. COCs will be obtained from the ovaries of female cats that undergo routine ovariohysterectomy procedures in commercial veterinary practices. The research will cover oocytes and CC both before and after in vitro maturation (IVM) under standard conditions [6]. The project covers 2 research threads: the analysis of LD and mRNA expression of 8 genes controlling lipid metabolism. Lipid drops and chromatin will be fluorescently stained (LD - BODIPY 493/50, chromatin - DAPI) according to the procedure used in our laboratory [2]. The evaluation of the slides under a confocal microscope will enable the characterization of LD and the assessment of the stage of oocyte meiosis. The analysis assumes optical sections every 10 µm (oocytes) and every 0.3 µm (CC), respectively. The LD parameters (size, number,% of the oocyte area occupied by LD) will be analyzed using ImageJ-Fiji. Transcript analysis of 8 genes (ACACA, FABP4, FASN, PNPLA2, CD36, PLIN2, SREBF1, PPARG) will be performed in oocytes and CC before and after IVM using the RT-qPCR technique used in our laboratory [2].
In summary, lipid metabolism is currently of particular interest to researchers due to its relationship with the quality of oocytes and embryos, not only in the context of freezing. Therefore, this issue is of key importance for the optimization of IVM / IVF / IVC procedures and the cryopreservation (vitrification) of domestic cat oocytes. The characterization of selected aspects of cat COC lipid metabolism is an excellent prelude to research aimed at a comprehensive analysis of the relationship between lipids and the efficiency of oocyte vitrification of this species. In addition, this project is an extension of the author's research to date in the field of biotechnology of reproduction of felids (IVF, vitrification) [6,7,8]. The results of this project will also improve understanding of lipid biogenesis in cat oocytes and oocyte-CC interactions.
[1] Guraya J Experimental Zool 1965
160: 123-35. [2] Pawlak P. et al. Biol Reprod 2020
103: 36-48. [3] Warzych et al. Theriogenology 2017
87: 36-47. [4] Galiguis at al. Cryobiology 2014
68: 459-66. [5] Warzych E. J Reprod Dev 2020
66: 1-7. [6] Mikołajewska N. et al. Reprod Domest Anim 2012
47 Suppl 6: 295-9. [7] Sowińska N. et al. Reprod Domest Anim 2016
51: 1-6 [8] Sowińska N. et al. Reprod Domest Anim 2017
00: 1–8.